鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及生物活性分析

[目的]研究鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及反应原性鉴定。[方法]将S1基因克隆到pMD18-T质粒载体上构建pMD18-T-IBV-S1载体;将目的基因插入原核表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点区,并将构建的重组质粒转化至宿主菌BL21中;IPTG诱导后的蛋白做SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析。[结果]S1基因在大肠杆菌中成功地进行了表达,表达的融合蛋白约为66kD,以包涵体形式存在。免疫印迹试验显示,重组蛋白可被IBV多克隆抗体识别。[结论]S1重组蛋白具有反应原性,为进一步研究IBV的新型疫苗奠定了基础。     

稻瘟病抗性基因Pi36原核表达载体构建·表达与鉴定

[目的]研究稻瘟病抗性基因Pi36的结构和功能。[方法]利用双酶切构建Pi36基因CC、NBS结构域的原核表达载体,通过菌落PCR鉴定和测序验证阳性克隆。然后分别收集不同浓度IPTG诱导,不同温度30和37℃分别培养的大肠杆菌细胞提取蛋白,利用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况。[结果]当IPTG浓度为1mmol/L、30℃培养3h,目的蛋白表达量最大。[结论]为进一步研究稻瘟病抗性基因Pi36的抗病机理奠定基础。     

铜绿假单胞菌脂肪酶基因(LipA)在枯草芽孢杆菌pab02中的整合表达

对铜绿假单胞菌脂肪酶基因(Lip A)进行克隆,构建整合表达质粒pHSG398–16S–lip A,并在枯草芽孢杆菌pab02中整合表达。根据铜绿假单胞菌Lip A基因设计引物,扩增Lip A基因,并进行测序,构建整合表达质粒pHSG398–16S–lip A,转化枯草芽孢杆菌pab02,并对转化后的阳性菌株进行诱导表达。结果显示,成功从铜绿假单胞菌A05菌株中扩增到长1 092 bp的Lip A基因,该基因与铜绿假单胞菌Lip A基因(登录号为AB290342)的同源性高达98%;该基因共编码311个氨基酸(aa),包含26个aa组成的信号肽和285个aa组成的成熟肽;成功构建了整合表达质粒pHSG398–16S–lip A,并将Lip A整合到枯草芽孢杆菌pab02染色体上,获得了重组枯草芽孢杆菌pab02–lip A;SDS–PAGE分析结果表明,脂肪酶蛋白得到了有效表达,该蛋白的相对分子质量约为37 000。     

油菜GDSL脂肪酶基因BnLIP1的克隆及其原核表达

克隆油菜GDSL脂肪酶基因BnLIP1,实现该基因在原核系统中重组表达,为研究其功能奠定基础。采用TRIzol法提取总RNA,通过RT-PCR法扩增BnLIP1编码序列,构建原核表达载体pEL1并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达后通过SDS-PAGE检测目的蛋白。根据GenBank报道的序列设计引物,从萌发的油菜种子黄化幼苗中成功克隆到BnLIP1的编码序列,长度为1170bp。将该编码序列构建到原核表达载体pET32a( )并与标签序列融合,在E.coliBL21菌株中成功表达了与标签蛋白融合的BnLIP1蛋白,大小约为61kDa。首次实现了油菜GDSL脂肪酶基因在原核系统中的表达,为GDSL脂肪酶Bn-LIP1蛋白的分离纯化及活性研究奠定了基础。     

香蕉MaASR1基因的生物信息学分析及原核表达

为了深入研究MaASR1基因的分子生物学功能,利用RT-PCR技术从拟南芥转基因株系L14中克隆到MaASR1基因的cDNA序列,该序列含有1个432 bp的开放阅读框,编码143个氨基酸的蛋白质,并对该序列进行了生物信息学分析。将该基因克隆到原核表达载体PET-30a中,经酶切和测序鉴定后,将正确的重组质粒p ET30aMaASR1导入大肠杆菌BL21(DE3),成功构建了该基因的原核表达载体。利用所构建的原核表达载体进行原核表达,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测,结果表明表达蛋白质与预期蛋白质大小基本一致。利用Ni柱亲和层析方法进一步获得了纯度较高的重组蛋白质,并用Western blot方法确定此重组蛋白质为目的蛋白质。     

绵羊激活素受体 IIB（ActRIIB）基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]旨在克隆绵羊激活素受体 IIB （ActRIIB）基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总 RNA反转录得到的 cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊 ActRIIB基因的 cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体 pET41a连接,构建重组表达质粒 pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1564 bp（ Genbank登陆号为：JX422071.1）,最大开放阅读框为1539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高（99.6%）,ActRIIB的 C末端区域高度同源且属于 TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小（约92 kD）并带有组氨酸标签序列的 ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊 ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]旨在克隆绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总RNA反转录得到的cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊ActRIIB基因的cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体pET41a连接,构建重组表达质粒pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1 564 bp(Genbank登陆号为:JX422071.1),最大开放阅读框为1 539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高(99.6%),ActRIIB的C末端区域高度同源且属于TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小(约92 kD)并带有组氨酸标签序列的ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

黄河鲤生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达

[目的]研究黄河鲤生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达。[方法] 从黄河鲤脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆黄河鲤的生长激素（GH）基因cDNA,分析其核苷酸序列和推测的氨基酸序列。[结果] 经克隆得到的黄河鲤生长激素基因的开放阅读框包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。将GH成熟肽的cDNA扩增并克隆入表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21（DE3）表达N 端含6个组氨酸的融合多肽。SDS-PAGE结果表明,0.1 mmol/L IPTG 诱导表达的蛋白约为23.5 kD,其表达量超过蛋白总量的50%,主要为不溶性的包涵体。包涵体经尿素溶解和亲和层析,获得了单一蛋白条带。[结论]该研究克隆到黄河鲤的生长激素基因,构建其原核表达质粒,得到了高效表达的基因工程菌。     

小麦热激蛋白60(HSP60)基因的克隆与原核表达

[目的]构建小麦热激蛋白60基因的原核表达载体,并在E.coli中进行高效表达。[方法]根据GenBank中收录的小麦热激蛋白60基因序列设计合成1对引物P1/P2,利用RT-PCR方法从小麦RNA中扩增小麦HSP60基因,应用基因重组技术构建pGEX-4T-1-HSP60表达载体,将构建好的小麦HSP60基因原核表达载体pGEX-4T-1-HSP60转化至大肠杆菌表达菌株E.coli-BL21感受态细胞。[结果]对重组质粒进行酶切分析及序列测定鉴定正确后,与GenBank中收录的小麦HSP60基因序列比对分析,同源性达100%。在IPTG诱导下获得了目的蛋白,所表达的GST-HSP60融合蛋白分子量约为90 KD。蛋白质电泳（SDS-PAGE）结果表明,表达的蛋白条带与预期的大小一致。[结论]成功构建了pGEX-4T-1-HSP60的原核表达载体,在E.coli-BL21中高效表达了HSP60蛋白,为进一步研究该蛋白的功能及其作用机制奠定了基础。     

小麦热激蛋白60(HSP60)基因的克隆与原核表达(摘要)(英文)

[目的]构建小麦热激蛋白60(HSP60)基因的原核表达载体,并在E.coli中进行高效表达。[方法]根据GenBank中收录的小麦HSP60基因序列设计合成1对引物P1/P2,利用RT-PCR方法从小麦RNA中扩增小麦HSP60基因,应用基因重组技术构建pGEX-4T-1-HSP60表达载体,将构建好的小麦HSP60基因原核表达载体pGEX-4T-1-HSP60转化至大肠杆菌表达菌株E.coliBL21感受态细胞。[结果]对重组质粒进行酶切分析及序列测定鉴定正确后,与GenBank中收录的小麦HSP60基因序列比对分析,同源性达100%。在IPTG诱导下获得了目的蛋白,所表达的GST-HSP60融合蛋白分子量约为90kD。蛋白质电泳(SDS-PAGE)结果表明,表达的蛋白条带与预期大小一致。[结论]成功构建了pGEX-4T-1-HSP60的原核表达载体,在E.coliBL21中高效表达了HSP60蛋白,为进一步研究该蛋白的功能及其作用机制奠定了基础。     

铜绿假单胞菌脂肪酶Lipase基因的原核表达(英文)

[Objective] The aim of this study was to investigate the prokaryotic expression of pseudomonas aeruginosa Lipase gene.[Method]Lipase gene was amplified by PCR from the genome DNA of pseudomonas aeruginosa,and its nucleotide sequence was determined.The prokaryotic expression vector of Lipase gene was constructed by the gene recombination technique.The protein expression was induced for 4 hours by IPTG with the final concentration of 1.0 mmol/L,and then SDS-PAGE electrophoresis was analyzed.[Result]The sequence of mature peptides in Lipase gene cloned from pseudomonas aeruginosa had a 99.36% homology with that of pseudomonas aeruginosa lipase submitted in NCBI,so the prokaryotic expression vector of Lipase gene pET32a-Lip was successfully constructed.Furthermore,the results of SDS-PAGE electrophoresis showed that the target gene was expressed highly and effectively.[Conclusion]The cloned pseudomonas aeruginosa lipase with its signal peptide could be normally expressed in E.coli and also used for further study.     

牛病毒性腹泻黏膜病毒E2基因的原核表达与免疫原性分析

[目的]原核表达牛病毒性腹泻黏膜病毒(BVDV)E2基因编码蛋白。[方法]采用PCR方法从BVDV中扩增E2基因片段,与原核表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒pET-32a-E2,转化E.coli(Rosetta)感受态细胞,重组菌用1 mmol/L IPTG诱导表达E2蛋白,进行SDS-PAGE电泳,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,经Western blot分析鉴定免疫原性。[结果]重组质粒pET-32aE2经PCR及酶切鉴定证明构建正确,重组质粒能够在大肠杆菌中大量表达,表达产物的分子质量大小约为58 kDa,纯化后E2重组蛋白浓度0.521 mg/mL,Western blot分析表明,其能被BVDV阳性血清识别,具有很好的免疫原性。[结论]E2蛋白成功表达,为后续建立BVDV检测方法奠定了基础。     

猪细小病毒(PPV)SD1株NS1基因的克隆与原核表达

[目的]为建立猪细小病毒的快速诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上猪细小病毒基因组序列和原核表达质粒pET30a(+)多克隆位点序列设计1对引物,应用PCR技术扩增出猪细小病毒SD1株NS1基因全序列,对阳性重组质粒进行测序和同源性比较。构建原核表达重组质粒pET 30a/NS1,并在大肠杆菌中进行诱导表达。[结果]通过PCR扩增获得2 208 bp目的片段。所克隆NS1基因与已报道的PPV相应基因的核苷酸同源性为97.3%~99.4%,表明NS1基因具有高度保守性,但在偏3′端连续缺失12个碱基。所克隆的PPVNS1基因在原核细胞中成功表达,其表达产物主要以包涵体形式存在。[结论]SDS-PAGE检测结果表明PPVNS1蛋白的分子量为86 kD。     

金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因的克隆及其原核表达(英文)

[Objective] The study aimed to clone the FnBP ligand binding gene of Staphylococcus aureus and run prokaryotic expression by constructing a prokaryotic expression vector. [Method] The gene encoding FnBP ligand binding gene was amplified from S.aureus chromosomal DNA by PCR technique. After T-A cloning, plasmid pMD18- FnBP was constructed. pMD18- FnBP and pET28a(+)were digested by BamH Ⅰ and EcoR Ⅰ double enzymes, then the purified FnBP ligand binding gene was subcloned into the expression vector pET28a(+), and the prokaryotic expression vector pET28a-FnBP was thus constructed. The constructed plasmid pET28a-FnBP was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) competent cells. The bacterium was induced by IPTG and the expressed products were analyzed by SDS-PAGE and Western blot. [Result] The gene fragment with the length of 370 bp was amplified by PCR approach. One approximately 30 kD exogenous protein was observed in SDS-PAGE analysis. Western blot analysis indicates the protein has antigenicity of S.aureus. [Conclusion] The FnBP ligand binding gene of S.aureus was successfully cloned and expressed in prokaryotic cells.     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备(英文)

[目的]为克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并鉴定。[方法]以以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,WesternΒlotting检测抗体的特异性。[结果]适构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可以高效表达NrfA蛋白,免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1:204900,经WesternBlotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,构建了表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。为研究细菌有关NrfA奠定了基础。     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备

[目的]克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并对其进行鉴定。[方法]以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,Western Blotting检测抗体的特异性。[结果]构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可高效表达NrfA蛋白;免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1∶204 900;经Western Blotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,并构建了其表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性,为研究细菌有关NrfA奠定了基础。     

黑白花奶牛白细胞介素-2基因的克隆和表达

[目的]克隆牛白细胞介素-2基因(IL-2),并观察其在原核细胞中的表达。[方法]应用RT-PCR技术从黑白花奶牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增编码牛IL-2基因,并将其克隆到pGEX-2T原核表达质粒中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析。[结果]通过RT-PCR扩增获得500 bp的目的片段,所克隆的IL-2基因在原核细胞中成功表达,表达产物为分子量约43 kD的融合蛋白。[结论]该研究为IL-2基因的进一步研究提供了理论依据和物质基础。     

肉牛肌生成抑制素成熟蛋白编码序列的克隆与原核表达

[目的]原核表达肉牛肌生成抑制素成熟蛋白编码序列基因并进行功能验证,为后期的小鼠接种实验打下基础。[方法]采用RT-PCR方法扩增肉牛MSTN成熟蛋白编码序列基因,该扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体pET28a（＋）中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE和Western-blot检测重组目的蛋白的表达结果。[结果]经Anti-His-Tag鉴定正确。[结论]肉牛MSTN成熟蛋白编码序列基因在原核表达系统中得到正确表达。     

O型口蹄疫病毒结构蛋白基因VP1的克隆与原核表达

[目的]为进一步研究口蹄疫病毒的诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上已公布的O型口蹄疫病毒核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,通过RT-PCR扩增VP1基因,将其克隆至表达载体pGEX-6p-1中,经测序鉴定目的基因正确地整合至表达质粒中,用IPTG诱导重组基因表达。[结果]通过PCR扩增获得682 bp的目的片段,所克隆的VP1基因在原核细胞中成功表达,表达产物为融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定分子量为51 kD,Western Blot结果表明融合蛋白具有免疫原性。[结论]获得了猪O型口蹄疫VP1融合蛋白,可作为包被抗原用于口蹄疫诊断试剂盒的研制。     

甘蓝型油菜BnClo1基因克隆、表达载体的构建及原核表达

【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读框738bp,编码245个氨基酸残基,caleosin分子量为28.1kD。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以20℃、4mmol·L-1IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个与理论值相符的83.1kD的融合蛋白intein-caleosin。【结论】克隆了油菜BnClo1基因,并在大肠杆菌中进行了优化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白,及研究其功能奠定了试验基础。