猪流行性腹泻病毒黑龙江分离株ORF3基因的克隆、表达及分子进化分析

克隆2017年黑龙江省大庆地区流行PEDV毒株(HLJ/DQ/2017)ORF3基因,通过真核表达及分子进化分析方法,为研究ORF3蛋白生物学功能提供重要的实验基础。TRIzol裂解法提取病毒RNA,RT-PCR技术扩增ORF3基因片段并测序,克隆至p EGFP-N1载体上,转染至HeLa细胞。应用DNAStar、DNAMAN、MEGA5.0软件进行序列比对和发育树绘制,应用Western Blot技术、Immunofluorescence技术检测ORF3蛋白的表达和细胞定位。经过酶切和测序验证p EGFP-N1载体中正确插入了ORF3基因,Western Blot法、Immunofluorescence法证实ORF3-EGFP融合蛋白聚集成核表达在HeLa细胞质的局部,由进化树分析显示,该毒株和2015年黑龙江地区流行的两个株毒株(HLJ/2015/116、HLJ/2015/DP1-1)位于同一群,但相比2011年黑龙江地区爆发的毒株(CH/HLJ/HH-2/2011),前者亲缘关系更近一些。融合蛋白ORF3-EGFP在HeLa细胞中聚集成核表达,遗传进化分析表明,该毒株与2015年黑龙江省流行的PEDV毒株相比无较大变异,且为目前世界最为流行的PEDV毒株类型。     

猪流行性腹泻病毒E基因真核表达载体的构建及融合蛋白的表达

E蛋白是猪流行性腹泻病毒的小膜蛋白,为了研究E蛋白在病毒侵染宿主细胞过程中的作用,构建了PEDV E基因的真核表达载体。通过RT-PCR技术扩增E基因片段,经双酶切连接至pEGFP-N1载体,酶切鉴定及测序结果证实PEDV E基因成功克隆到pEGFP-N1中,并将重组质粒命名为pEGFP-N1-E。将pEGFP-N1-E转染He La,利用Western Blot和免疫荧光技术检测pEGFP-N1-E的表达以及定位情况,结果显示pEGFP-N1-E在He La细胞中成功表达,并且在胞质胞核均匀分布。结果表明:pEGFP-N1-E已被成功构建,并且在He La细胞中正确表达。为后续研究关于E基因的功能及其在抗病毒中所发挥的作用等方面奠定了研究基础。     

EV71病毒诱导细胞应激颗粒形成的初步研究

肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)属于小RNA病毒科,肠道病毒属,肠道病毒A型的成员,是引起婴幼儿手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)的一种重要病原病毒。但截至目前,EV71病毒与宿主细胞相互作用的机制仍不清楚。为了研究EV71病毒诱导应激颗粒形成的分子机制,研究首先构建了真核表达载体pDsRed2-G3BP1,随后构建了稳定表达融合蛋白RFP-G3BP1蛋白的HeLa细胞系(HeLaRFP-G3BP1),并应用Western Blot和免疫荧光技术证实了G3BP1融合蛋白的正确表达。EV71病毒感染HeLaRFP-G3BP1后,超过40%感染细胞的胞质中出现了应激颗粒。此外,应用微管特异性抑制剂破坏细胞微管完整性之后,显著抑制应激颗粒的迁移聚集。研究证明了EV71病毒诱导细胞应激颗粒的初步形成并且应激颗粒的迁移聚集依赖于微管的完整性。     

EV71病毒3C蛋白真核表达载体的构建及表达

[目的]构建EV71病毒3C蛋白的真核表达载体,并验证其在细胞中的正确表达。[方法]采用RT-PCR技术,从EV71病毒基因组RNA中扩增3C基因,克隆到真核表达载体pc DNA3.0-Flag上,并转染He La细胞,通过Western blot和免疫荧光验证3C蛋白的表达。[结果]酶切及测序鉴定显示,EV71病毒3C真核表达载体构建成功。Western blot和免疫荧光结果证实3C蛋白在He La细胞中成功表达。[结论]该研究成功构建了真核表达载体pc DNA3.0-Flag-3C,为进一步研究EV71病毒3C蛋白生物学功能奠定了一定基础。