HIV-1可溶性单链抗体b12-scFv的表达与活性分析

【目的】合成并克隆HIV-1单克隆抗体b12的单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达,并分析表达产物的活性。【方法】以单抗b12的重链和轻链全基因为模板,分别扩增其可变区基因片段后,用重叠PCR的方法将二者拼接起来,形成scFv-VL-Linker-VH结构,并将其插入pET28a载体,构建原核表达载体pETb12-scFv。将pETb12-scFv转入大肠杆菌BL21StarTM(DE3),经IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析;用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达产物进行分离纯化,用酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光显微镜和流式细胞仪(FCM)检测纯化蛋白与HIV-1gp120的结合活性。【结果】得到了b12的单链抗体基因b12-scFv,长度为768bp;SDS-PAGE电泳结果显示,b12-scFv表达量较高,蛋白质分子质量约为29ku,主要以可溶性蛋白的形式存在,但也有部分形成不溶的包涵体;纯化后蛋白的产量约为2mg/L;活性检测结果表明,b12-scFv对分泌表达和锚定在细胞膜表面的HIV-1gp120都具有良好的特异性结合活性。【结论】单链抗体b12-scFv可以用于HIV-1受体结合位点的表位检测。     

IBV单链抗体的筛选及其互补决定区序列变异分析

【目的】筛选能表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)单链抗体(scFv)的原核阳性克隆,并分析scFv抗原结合位点的氨基酸变化。【方法】采用RT-PCR,从IBV疫苗免疫的鸡脾脏RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因。利用重组链延伸反应(SOE-PCR),将linker与VH和VL基因相连构建鸡scFv基因,并将其克隆到原核表达载体pOPE101-XP中,构建重组质粒并转入大肠杆菌表达,间接ELISA筛选原核表达的抗IBVscFv的阳性克隆,对其测序后进行Clustal.W多序列比较,分析scFv骨架区(FR)和互补决定区(CDR)氨基酸序列差异。【结果】筛选到表达IBVscFv的阳性克隆ZL.10和ZL.80;将它们的氨基酸序列与鸡胚系Gemline进行多序列比较,结果显示,ZL.10、ZL.80在CDR中易变异氨基酸占各区氨基酸的比率均在40%以上,其中VH的CDR3达90%,VL的CDR3达60%。此外,ZL.10、ZL.80在VH的CDR3区分别增加5个和7个氨基酸。FR氨基酸变异率较少,且大多均在12%以下,而FR4未发生突变。【结论】通过体外筛选原核表达产物的方法,获得了表达IBVscFv的阳性克隆ZL.10和ZL.80,其VH、VL氨基酸序列中的变异主要发生在各自的CDR,二者VH的CDR3氨基酸序列差异很大,提示这2个scFv阳性克隆针对的是IBV不同的抗原位点。     

泛素样小蛋白4(SUMO4)的克隆、原核表达、纯化及鉴定

【目的】为人类泛素样小蛋白4(SUMO4)多克隆抗体制备和疾病研究奠定基础。【方法】根据Gen-Bank提供的核酸序列,设计7条单链DNA,采用重叠延伸PCR方法,合成SUMO4基因编码区。基因片段经限制性内切酶双酶切,构建到表达载体pGEX-4T-1中。酶切、测序鉴定后,将重组子转染BL21 RIL菌株,表达及纯化融合蛋白。用SDS-PAGE和Western blot检测纯化效果,鉴定表达产物。【结果】成功合成了长度约为280 bp的SUMO4基因,经双酶切鉴定,SUMO4原核表达载体构建成功,插入片段测序正确。GST-SUMO4融合蛋白在终浓度1mmol/L IPTG、28℃诱导5 h后产量达到高峰,SDS-PAGE证实表达产物以可溶形式存在,分子量约为37 ku,GST亲和层析的纯化效果良好,Western blot验证融合蛋白分子量与预期值相符。【结论】SUMO4蛋白在大肠杆菌中高效表达,并以可溶性蛋白形式存在。     

柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体基因的构建及表达产物的生物学活性分析

 【目的】构建鼠源抗柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体(dsFv)片段基因,原核表达并将其复性为具有免疫活性的dsFv抗体。【方法】采用PCR定点突变的方法构建dsFv重链(VH)及轻链可变区(VL)基因,分别将其连接入表达载体中,于E.coli BL21(DE3)中诱导表达,表达产物溶解后稀释入复性缓冲液中使其重折叠为dsFv抗体并纯化。SDS-PAGE及Western-blot分析表达及复性产物,BIAcore检测dsFv与Xac-LPS的亲和力,ELISA验证dsFv的特异性及稳定性。【结果】测序结果表明在VH的44位和VL的100位成功引入了半胱氨酸突变位点,实现了高效的原核表达,表达产物主要以包涵体的形式存在。SDS-PAGE分析显示VH和VL的大小为23 kD,并将其成功复性,复性后大小为46 kD。BIAcore分析表明dsFv对Xac-LPS保持了很高的亲和力,亲和常数(KD)达到3.40×10-10M。ELISA证明dsFv具有较高的抗原特异性并且热稳定性较scFv提高近20℃。【结论】成功表达并复性了dsFv抗体,为柑橘溃疡病菌的免疫诊断提供了高效优质的重组抗体。     

抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建

 【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体（single chain variable fragment,ScFv）基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750 bp,其中重链可变区（VH）基因有360 bp,轻链可变区（VL）基因有342 bp,中间连接肽基因45 bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5 kD的ScFv重组蛋白。【结论】试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质的研究打下了基础。     

抗堆型艾美耳球虫子孢子单链抗体的构建及表达

应用RT-PCR技术,从稳定分泌抗堆型艾美耳球虫子孢子抗原的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞Easp-3G3中扩增出抗体VH和VL基因,通过在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗堆型艾美耳球虫的单链抗体基因,并将其克隆至表达载体pET28a( )载体中进行表达,用Ni-NTA的金属亲和层析法进行纯化,通过SDS-PAGE和ELISA测定其纯度和生物学活性.电泳结果分析表明重组蛋白的相对分子量为32kDa,纯度为94%;ELISA反应结果证明该单链抗体保持了单克隆抗体的生物学特性,并能与堆型艾美耳球虫子孢子抗原发生特异性反应.     

弓形虫棒状体蛋白15的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

【目的】克隆弓形虫（Toxoplasma gondii）RH虫株速殖子的棒状体蛋白15(ROP15)基因,原核表达、纯化重组蛋白,并制备多克隆抗体。【方法】根据GenBank登录的弓形虫RH株ROP15(DQ096561.1)基因序列设计了1对引物,以提取的弓形虫RH虫株速殖子RNA为模板,通过RT-PCR获得该虫株的ROP15基因,将该基因连接至原核表达载体pGEX-4T-1上,获得重组质粒pGEX-4T-ROP15,测序结果与预期结果一致;转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导获得重组融合蛋白,运用亲和层析法纯化可溶性ROP15重组蛋白,SDS-PAGE对表达和纯化的目的蛋白进行分析。用纯化的ROP15重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,运用Western blot分析特异性。【结果】成功克隆了弓形虫RH虫株速殖子ROP15基因,大小为924 bp;菌液PCR和酶切鉴定表明重组质粒pGEX-4T-ROP15构建成功,获得了约59 ku的可溶性融合蛋白表达产物;以纯化的可溶性ROP15重组表达蛋白为抗原制备兔源性抗血清,Western blot显示该多克隆抗体与ROP...     

兔出血症病毒VPg蛋白的原核表达及抗体制备

【目的】构建重组兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)VPg(Viral Protein Ge-nome-Linked,VPg)蛋白基因的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化VPg蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体的基本特性。【方法】用PCR方法扩增RHDVVPg基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,使之重组表达VPg蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。PCR扩增获得了345bp的VPg基因,用纯化的重组VPg蛋白免疫试验兔,制备抗VPg的多克隆抗体,用Western blot检测其特异性。【结果】构建了pET-30a/VPg原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株后,成功表达了VPg蛋白。用该蛋白免疫试验兔后,制备的多克隆抗体能与VPg蛋白特异性反应。【结论】成功表达了RHDV VPg蛋白,并制备了特异性良好的多克隆抗体。     

PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建及淘选

用重组的PCV2Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,从免疫小鼠脾细胞中提取总RNA,经反转录后,扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap PCR方法将VH基因和VL基因组装成单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB-5E中,并将重组载体转化至感受态大肠杆菌TG1中,获得PCV2Cap蛋白的单链抗体文库,经测定抗体库库容为3.58×106。通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建鼠源PCV2Cap蛋白的噬菌体单链抗体库。4轮生物淘选后,经ELISA方法检测,最终获得3株能与Cap蛋白特异性结合的噬菌体克隆。     

抗利巴韦林单链抗体基因构建及其结构分析

【目的】克隆构建利巴韦林(RBV)单链抗体(scFv)基因,对其理化特性进行分析并对蛋白质结构进行模拟,为后期检测方法的建立及分子改造提供参考依据。【方法】以分泌利巴韦林抗体的杂交瘤细胞株总RNA为模板,通过RT-PCR技术扩增抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),然后以柔性连接短肽(Gly_4Ser)_3为接头拼接完整的scFv-RBV。利用生物信息学方法对scFv-RBV的理化性质及蛋白结构功能进行预测分析。【结果】构建的scFv基因编码240个氨基酸,相对分子质量为26 162.27 Da,理论等电点(pI)为8.57。在二级结构中,β-折叠(39.17%)和无规卷曲(45.41%)占主导地位,α-螺旋(5.42%)和β-转角(10%)相对较少。在三级结构中,VH和VL区域被Linker相互牵拉靠近,形成典型的口袋样形状的空间构象,符合单链抗体的结构特征,理论上可以与RBV抗原特异性结合。【结论】成功构建scFv-RBV基因,并利用生物信息学方法预测分析scFv的二级、三级结构,该结果可为后期进行单链抗体的表达、纯化及定向进化提供理论支撑。     

山茱萸多糖提取工艺优化及马钱苷含量测定

采用L（934）正交设计试验,对山茱萸浸提液中山茱萸多糖的酶水解法提取工艺进行了优化研究,并对浸提液的中有效成分马钱苷含量进行了HPLC法分析。结果表明,山茱萸多糖浸提的最佳工艺为：液料比1∶5,浸提时间4 h,浸提温度80℃,果胶酶添加量0.55 g/L。用HPLC法测定出的山茱萸浸提液中马钱苷平均含量为0.512 ...     

生态旅游潜在客源市场特征的调查研究--以湖南永州金洞森林旅游开发为例

为探明客源市场生态旅游消费的潜在特征，采用问卷调查的形式，就长沙市居民对湖南金洞生态旅游开发的意向等问题进行抽样调查．结果显示，生态旅游符合人们“回归自然”的旅游新时尚，有着极大的开发空间，指出生态旅游的开发要注重环境保护和可持续发展．开发的产品要以休闲度假类的大众产品为主，开发生态旅游都市客源市场还要多种渠道并用，尤其是要注重媒体的宣传．     

《河北农业大学学报》创刊年代考

清光绪二十八年(1902)河北农业大学前身—直隶农务学堂诞生,经几易其名,于1958年更名为河北农业大学至今。清光绪三十一年(1905)直隶高等农业学堂时期创办了《北直农话报》,清光绪三十四年(1908)更名为《直隶农务官报》,中华民国七年(1918)改出《农学月刊》,中华民国十七年(1928)易名为《河大农刊》,中华民国二十三年(1934)更名为《河北通俗农刊》,中华民国二十四年(1935)易名为《河北农林学刊》,1948年更名为《河北农学院研究专刊》,1959年更名为《河北农业大学学报》至今。《河北农业大学学报》前身诸刊都与现时的《河北农业大学学报》有着一脉相承的历史渊源,各刊之间联系紧密,连续性、继承性强。因此,《河北农业大学学报》的创刊时间应追溯至1905年创办的《北直农话报》。     

浅谈饲料中有效能的测定技术

饲料中有效能是供动物生长发育的基础.不同动物所用的有效能体系不同,目前大多数动物采用消化能、代谢能体系,但随着研究的发展与深入,发现最能反映饲料有效能的是净能体系.无论哪种体系,采用合理的测定技术准确测定饲料中的有效能值显得尤其重要,通过对饲料有效能值的准确测定可以实现动物所需能量的精确供给,减少养殖成本,使经济效益最大化.文章综述了几种有效能评价体系的测定技术.     

水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的纯化技术

应用萄聚糖凝胶柱层析对水牛梭形住肉孢子虫包囊包溶性抗原进行了纯化。结果表明：纯化水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的最适条件为：选用萄聚糖凝胶Ｇ—１００柱层析系统；洗脱液为０３ＭＰＢＳ（ｐＨ７２），床体积为１０ｃｍ×１６５ｃｍ，上样体积为５００ＨＬ；流速为１２ｍＬ／ｈ。纯化抗原可使琼脂凝胶双扩散试验的阳性检出率提高３０％。     

黑豆不同部分馏油的体外抗氧化性比较

[目的]通过体外抗氧化体系比较黑豆不同部分馏油抗氧化性活性。[方法]通过正交试验优化索氏提取黑豆馏油的最佳工艺,提取黑豆不同部分馏油;研究黑豆不同部分馏油对羟基自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)的清除能力。[结果]在样品浓度为1.0 mg/mL时,黑豆不同部分馏油对·OH的清除率分别为全豆馏油83.9%、豆黄(黑豆去皮部分)馏油64.8%、豆皮馏油17.3%,对DPPH·的清除率分别为全豆馏油41.3%、豆黄馏油33.2%、豆皮馏油77.9%。[结论]黑豆不同部分馏油均具有较好的抗氧化性,是良好的天然抗氧化剂。黑豆不同部分馏油对·OH的清除能力从大到小依次为全豆馏油、豆黄馏油、豆皮馏油,对DPPH·的清除能力从大到小依次为豆皮馏油、全豆馏油、豆黄馏油。     

姬松茸碳源利用规律的研究

试验采用麦秸培养基,系统研究了姬松茸在生长期间对碳源的利用规律。结果表明,姬松茸降解的有机物质绝大部分被菌体的呼吸过程消耗掉,绝对生物学效率较低;在菌丝生长阶段,木质素的降解速率大于纤维素和半纤维素,这对纤维素和半纤维素的降解十分有利;非木质纤维素组分在菌丝生长阶段被主要利用,而木质纤维素则是子实体生长阶段的主要碳源。且就整个栽培过程而言,姬松茸生长发育所需要的79.86%的碳源来自木质纤维素。     

精胺对菊花蕾期叶片生理及花期形态的影响

研究了不同浓度(0,0.1,0.2,0.5mmol·L-1)的精胺(Spm)对菊花品种兼六香菊绿蕾期叶片生理生化、开花时期和花期形态的影响.结果表明,Spm可使菊花蕾期叶片中硝酸还原酶(NR)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性及叶绿素(Chl)和可溶性蛋白含量都比对照组有不同程度的提高.处理组花期的花径、株径、株高均高于对照组,外观株型整体比对照美观,其中以0.1 mmol·L-1处理的效果最明显,开花时间比对照提前3d,整个花期延长10d.     

闽东桉树幼树高生长的灰色分析

本文应用GM（1,1）模型分析闽东几种桉树幼树的高生长过程。结果表明,桉树幼林高生长是平衡的。作用于树高生长的灰因子集随年龄增长而加强。     

切花菊耐热性鉴定方法研究

以8个切花菊品种为材料,通过对离体叶片进行50℃高温胁迫后,采用电导法、电阻抗图谱法测定电导率、电阻,并对大田栽培植株进行田间高温胁迫试验,比较品种间的耐热性。结果表明:电导法测得的50℃直接相对电导率、修正相对电导率和电阻抗图谱法测得的胞外电阻在品种间有明显差异,但与田间高温胁迫法测定的热害指数不完全一致。电导法和电阻抗图谱法都可以作为测定切花菊耐热性的方法,但需要结合田间耐热性观察。