中国水牛三种住肉孢子虫包囊的比较电镜研究

对采自中国湖南水牛食道肌内大小不同的包囊进行了比较研究和描述。透射电镜观察的结果显示:大包囊(9.3mm×3.4mm)的超微结构与已报道的水牛梭形住肉孢子虫S. arcocystis justprmis一致,包囊壁表面形成带有分支的菜椰花样的突起,突起内含纤丝和基质,基质层向腔内形成隔,细胞排列疏松;小包囊的一种(2.4mm×0.2mm)与已报道的水牛利文往肉孢子虫S.levtnei的一致,包囊壁表现形成倾斜的长绒毛样的突起,突起内含纤丝,致密颗粒和基质,有隔,细胞排列不甚紧密,而另一种小包囊(0.94mm×0.17mm)则与黄牛的枯氏住肉孢子虫cruzi的一致,包囊壁表面形成倒伏的指状突起,突起内不含纤丝和致密颗粒,有隔,细胞排列紧密。这一观察表明,我国水牛存在三种住肉孢于虫,即梭形住肉孢子虫、利文住肉孢子虫和枯氏住肉孢子虫。     

梭形住肉孢子虫和巨型住肉孢子虫包囊各部分的免疫特性研究

运用对流免疫电泳(CIE)和酶联免疫吸附试验(ELISA)对梭形住肉孢子虫和巨型住肉孢子虫的包囊壁、包囊液、缓殖子及全色囊抗原的免疫特性进行了比较研究。结果表明:缓殖子抗原对抗血清的免疫反应最强.     

PCR技术在住肉孢子虫虫种鉴定上的应用

采用 RAPD 方法对水牛梭形住内孢子虫、待定种及黄牛枯氏住内孢子虫缓殖子基因组 DNA 进行了分析,待定种 PCR 产物的电泳带型与枯氏住肉孢子虫的差异较梭形住内孢子虫大,这与二者表型性状一致的研究结果不吻合.对3种包囊种特异性的 PCR 指纹进行了筛选,回收和纯化了3种包囊种特异性的 DNA 片段,待定种0.7kb 片段经α-~(32)PdATP 标记后用作探针,只与同源 DNA 杂交,不与其它包囊、宿主细胞和艾美耳球虫杂交,用 pGEM-T Easy Vector 对该片段克隆成功,并测出其全长序列,为进一步设计特异引物建立标准 PCR 诊断方法和用作核酸探针奠定了基础。     

交叉感染后黄牛与水牛枯氏住肉孢子虫包囊超微结构的比较研究

试验选用4头7日龄奶牛和4头4～5月龄水牛,用水牛源孢子囊感染黄牛及黄牛源孢子囊感染水牛,同时设感染对照和不感染对照,对交叉感染后黄牛与水牛体内包囊的超策结构进行了比较研究,观察结果发现两种来源的包囊无结构区别,所有包囊的超微结构与前人对黄牛与水牛枯氏住肉孢子虫Sarcocystis cruzi的描述一致,进一步地证实水牛是枯氏住肉孢子虫的新中间宿主。此外,作者首次在枯氏住内孢子虫包囊内的母细胞和缓殖于发现晶状体。     

黄牛住肉孢子虫超微结构研究

依据电镜下包囊的超微结构从黄牛肌肉中鉴别出３种住肉孢子虫：枯氏住内孢子虫、毛形住肉孢子虫和人住肉孢子虫。估氏住内孢子虫超微结构的特点是,原囊壁向表面突出形成倒伏的指形突起,突起内无纤丝、微管和致密颗粒。毛形住内孢子虫与人住内孢子虫的年轻包囊很难区别,其包囊突起均为栅栏样构造,突起内有纤丝,而老包囊在毛形住肉孢子虫与人住内孢子虫之间有明显区别,前者突起的壁平滑,突起内有纤丝,而后者突起壁呈波浪形,突起内有微管和致密颗粒。     

绵羊住肉孢子虫的超微结构

利用电镜下包囊的超微结构从绵羊鉴别出3种住肉孢子虫,它们是巨型住肉孢子虫、绵羊犬住肉孢子虫、羯犬住肉孢子虫。巨型住肉孢子虫的包囊壁由次生壁和原囊壁组成,原囊壁形成的突起呈花椰菜样,突起内含有管状纤丝和致密颗粒。绵羊犬住肉孢子虫的原囊壁向表面形成栅栏样的突起,突起内无纤丝和致密颗粒。羯犬住肉孢子的原囊壁向表面皱褶形成条带状突起,突起内无纤丝,含少量致密颗粒。在绵羊体内还发现一待定种,其原囊壁向表面形成指形突起,突起内不含纤丝和致密颗粒。     

云南猪住肉孢子虫的动物感染试验

 用大理、昆明、文山等地收集到的含猪住肉孢子虫包囊的生猪肉分别喂给实验猴、猫、犬,感染后第11天、第7天和第10天在猴、猫和犬的粪便中出现孢子囊。3种孢子囊的平均大小分别为13.50μm×10.25μm,11.75μm×9.25μm,13.25μm×10.75μm。从实验猴、猫、犬的粪便中分离收集孢子囊,分别接种给3头断奶仔猪。75天后剖检,在猪的心肌和骨骼肌中发现各种住肉孢子虫的包囊。包囊呈梭状、椭圆形或长椭圆形,并分隔成许多隔室,室中充满新月形缓殖子和卵圆形的母细胞,缓殖子的平均大小分别为10.86μm×5.24μm,10.04μm×4.84μm,11.14μm×5.74μm。结果表明云南有3种猪住肉孢子虫,即猪人住肉孢子虫,猪猫住肉孢子虫和米氏住肉孢子虫。     

中国水牛利文住肉孢子虫包囊的超微结构

利用透射电镜对采自湖南水牛的利文住肉孢子虫包囊的超微结构进行了研究。原囊壁向表面皱折形成倾斜的长绒毛状突起,突起壁呈波浪形起伏,突起内含有弥散的致密颗粒和纤丝,该纤丝是由8个亚单位构成的管状物;基质层衬在原囊壁之下,并向内伸入形成隔,将囊腔分隔成若干小室。包囊内缓殖子的微线有400左右,核位于身体的后部,包囊的体积为2.4mm×0.2mm,大于原作者的描述。     

猪米氏住肉孢子虫包囊的光镜与电镜研究

利用光镜和电镜研究了猪肌肉内米氏住肉孢子虫的形态学。包囊体积为0.525～1.250mm×0.075～0.025mm,平均0.822mm×0.156mm。包囊壁形成大量平行的栅栏样的突起,光镜下是呈放射条纹状的厚壁,电镜下可见突起壁下74～86根纤丝形成一单环,突起中央有7～16簇由2～8根纤丝组成和纤丝束。基质层衬于包囊壁下,并向腔内伸入形成隔。包囊内细胞按内二分裂方式增殖,其结构特征与其它形成包囊的球虫相同。研究证明米氏住肉孢子虫包囊壁的超微结构特征不同于本属内的其它虫种,可作为鉴别的标志。     

无性系杉木的物理力学性质

对浙江省开化林场９年生无性系杉木和实生苗杉木木材的物理力学性质进行了测定比较。结果表明，在测定的１５个无性系中，有的优于实生苗杉木，有的次于实生苗杉木。无性系杉木材的平均气干密度为０３４０ｇ·ｃｍ－３，基本密度０２８０ｇ·ｃｍ－３，径向干缩系数０１３１％，弦向干缩系数０２１７％，体积干缩系数０４０１％，抗弯强度４４３５５ＭＰａ，抗弯弹性模量８２９６ＧＰａ，冲击韧性３２９５０ｋＪ·ｍ－２。     

鸡免疫球蛋白G的提纯及定量测定

从成年鸡血清中用硫酸铵三次沉淀粗提r球蛋白。然后,用G200凝胶柱过滤,洗脱液含O.14M NaCl,0.01M PB,流速6—8滴/分。取第二峰,用DE52纤维素柱层析,洗脱液是0.1M PH7.0 PBS。洗脱蛋白用免疫电泳等技术鉴定为纯化IgG。以此抗原1毫克加福氏完全佐剂首次免疫家兔后,再用同种抗原2—3次加强免疫,总蛋白用量3—5毫克。兔抗鸡IgG抗血清效价在1:16—1:32以上。以单向免疫扩散试验,测出不同周龄鸡血清中IgG的含量: 2周龄:2.9117±0.0779(n=20); 4周龄:3.8748±O.0591 (n=20); 10—13周龄:8.2243±O.4000 (n=59); 18—21周龄:13.3107±0.7434(n=44);     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

在最佳条件下,通过对重组质粒pGEX-6P-N进行诱导表达,并利用Glutathione Sepharose 4B亲和吸附柱对表达产物（重组N蛋白）进行纯化。用重组N蛋白作为包被抗原,通过对相关条件进行优化（如抗原包被量,血清稀释度,酶标二抗最佳工作浓度,底物作用时间等）,确定判定标准,最终初步建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。用建立的间接ELISA方法检测360份血清样品,并与IDEXX公司研制的ELISA试剂盒检测的结果相比较,批内重复性试验变异系数均值为1.52%,批间变异系数为6.17%,符合率达92.5%,试验表明,建立的间接ELISA检测方法具有良好的重复性和特异性,可用于PRRSV血清抗体的检测。     

牛脑钙调素的分离纯化、鉴定及其免疫原制备

【目的】从牛脑中分离纯化钙调素(CaM),并进行生化鉴定,同时用碳二亚胺法制备CaM偶联免疫原。【方法】以phenyl-Sepharose层析法从牛脑中分离纯化CaM,用PDE法检测其活性,以SDS-PAGE、PAGE检测其分子量并观察CaM有无Ca2+结合时的电泳行为,检测其紫外扫描光谱,同时用交联剂碳二亚胺制备CaM偶联抗原进行动物免疫,并用间接Elisa法检测动物血清免疫效价。【结果】纯化后的CaM对PDE有明显的激活作用,电泳结果显示为均一条带,分子量约为17.3 kDa,在SDS-PAGE中,CaM结合Ca2+时比未结合Ca2+时迁移率快;而在PAGE中,迁移率在结合Ca2+比未结合Ca2+时慢;紫外光谱扫描显示约在251、260、267、272和283 nm有5个吸收峰,动物血清免疫效价为1∶800。【结论】用phenyl-Sepharose层析法纯化CaM和用碳二亚胺法制备CaM偶联抗原是成功的。     

豌豆蚜Jun蛋白的原核表达与抗体制备

对豌豆蚜Jun蛋白进行原核表达进而进行抗体制备，可为探究JNK通路对靶基因的调控机制奠定材料基础。本研究提取豌豆蚜的总RNA，经反转录、PCR扩增后进行原核表达与抗体制备，并用ELASA法测定其抗血清效价、Western-Blot法检测抗体特异性。结果表明：本文所构建的pET-28a-SUMO表达载体能在大肠杆菌体内成功表达出Jun蛋白，并通过免疫兔子成功制备了多克隆抗体，其抗血清效价良好、抗体特异性较好。本研究成功表达出豌豆蚜Jun蛋白，并成功制备出抗体，可用于下步试验，对进一步探究JNK通路对靶基因的调控机制具有重要意义。     

新疆芜菁多糖降血糖作用的研究

【目的】检测新疆芜菁多糖的组分结构与对血糖的作用。【方法】采用常规的水提法从芜菁中提取粗多糖,并用Sevag法对其进行脱蛋白,再通过回流、透析等步骤把粗多糖纯化获得芜菁精制多糖。用芜菁精制多糖进行小白鼠血糖实验。对芜菁精制多糖进行DEAE-52离子交换柱层析纯化,对第一个洗脱组分BRPS1再进行Sephadex G-200凝胶柱层析纯度鉴定。此外,用红外光谱法分析BRPS1,并且对离子交换柱层析的7种洗脱组分分别进行了GC-MS分析。【结果】当芜菁精制多糖剂量为400 mg/kg体重时,3 d后的受试小鼠血糖值下降差异显著(P<0.05);6和9 d后的血糖值下降差异极显著(分别是P<0.01和P<0.001);通过DEAE-52离子交换柱层析共分离出7种组分。对第一个洗脱组分BRPS1的Sephadex G-200凝胶柱层析的结果表明,BRPS1是单一的多糖组分;其红外图谱结果表明BRPS1具有多糖的一般结构。对7种洗脱组分的GC-MS分析表明芜菁精制多糖含有6种单糖。【结论】芜菁多糖具有显著的降血糖效果;作为芜菁多糖主要成分的BRPS1为单纯的多糖,具有多糖的一般结构。     

Prokaryotic Expression, Ascitic Polyclonal Antibody Preparation and Identification of Cashmere Goat Izumol

Izumol is a novel member of the immunoglobulin superfamily locating on sperm, and is indispensable for sperm-egg fusion. According to its immunoglobulin-like domain in the extracellular region, Izumol was fractionated into 6 fragments （F0-F5） which were ligated with pGEX-4T1 to construct the prokaryotic expression vectors pGEX-Fn. The recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli BL21 （DE3） and the GST-Fn fusion proteins were expressed successfully by induction with IPTG. GST-F0, a recombinant fusion protein of GST with the full length of extracellular region of mature cashmere goat Izumol, was purified by polyacrylamide gel slicing method and was used as an antigen to immunize the Kunming mouse to generate anti-GST-Izumol ascetic polyclonal antibody with intraperitoneal injection of S 180 cells. Subsequently, the anti-GST-Izumol polyclonal antibody was purified with miscellaneous antigen by glutaraldehyde cross-linking method. Western blotting analysis showed that the purified ascetic polyclonal antibody had high affinity to all 6 GST-Izumol fragment fusion proteins. Immunohistochemical analysis with this antibody displayed that the cashmere goat Izumol proteins were at the equatorial segment of sperm head surface. These results indicate that this polyclonal antibody has high specificity and lays the foundations for further study on the expression pattern of Izumol in cashmere goat testis and binding abilities of each extra-membrane fragment of Izumol to the egg surface.     

新孢子虫病P43蛋白质(包涵体)的纯化及rELISA方法的建立

为建立新孢子虫病间接酶联免疫吸附试验(rELISA)检测方法,先诱导表达GST-P43包涵体蛋白,并对其进行提取、纯化、复性处理,再以复性后的P43蛋白作为抗原,优化rELISA检测方法。结果表明,这种包涵体处理方法,可使其纯度达到87%,复性后的目的蛋白具有良好的免疫活性。通过对rELISA各反应条件的优化,确定了最佳反应条件,血清稀释倍数为1∶100,抗原包被浓度为7μg/mL,封闭液为0.5%脱脂乳,酶标抗体的工作浓度为1∶4000,酶标抗体作用时间为1 h,底物作用时间25 min。且该方法不与弓形虫和布鲁氏菌病发生交叉反应。     

发酵苹果渣多糖分离纯化、结构及其与加工特性的关系

【目的】在研究发酵苹果渣多糖分离纯化动态趋势的基础上,对其结构特性进行深入研究,进一步探究发酵苹果渣多糖分离纯化、活性及加工特性。【方法】以苹果原渣多糖(apple pomace polysaccharides,AP)、苹果酒渣多糖(wine fermented apple pomace polysaccharides,WFP)、苹果醋渣多糖(vinegar fermented apple pomace polysaccharides,VFP)为原料,对其含量进行分析,利用发酵苹果渣多糖不同组分间极性差异,采用DEAE-52纤维素,以Na Cl溶液进行梯度洗脱,部分收集器进行逐管收集,苯酚硫酸法测定吸光值,制作洗脱曲线;同时,对DEAE-52纤维素层析所得组分利用去离子水经Sephadex G-200凝胶柱,根据一定分子量截留的特点进行进一步分离纯化,测定所得组分纯度后,对不同组分进行结构表征,主要包括X衍射仪(XRD)观察晶体结构、热重分析仪进行热重分析(TG)、激光粒度仪对溶液粒度进行分析(LPSA)、同时通过刚果红试验探究其是否具有三螺旋结构,运用台式扫面电镜进行微观结构分析。【结果】粗多糖含量达到70%左右,同时不含蛋白质、核酸,提取效率较高;AP在0.1和0.2 mol·L-1 Na Cl洗脱液浓度下经DEAE-52纤维素层析、Sephadex G-200凝胶层析可得NAP0.1、NAP0.2;WFP在0.0、0.1和0.2 mol·L-1 Na Cl浓度洗脱下可得NWFP0、NWFP0.1、NWFP0.2,VFP可得NVFP0、NVFP0.1、NVFP0.2,以上所得成分含量均达到92%以上,分离纯化效果良好;3种多糖分离纯化前后皆为非晶态物质,呈无定型结构;多糖溶液浓缩过程温度应低于65℃,在加工中应注意控制温度在150℃以内;分离纯化前,3种多糖都存在三螺旋结构,分离纯化后,组分NWFP0、NVFP0、NVFP0.1出现了三螺旋结构,AP经分离纯化无三螺旋结构成分出现;苹果渣多糖在分离纯化后更加稳定,粒径差异更小,主要表现在经分离纯化后多糖的粒径分散系数更小;分离纯化导致片状结构变小,交联作用减弱,能更好发挥其生物活性。【结论】发酵苹果渣多糖含量达70%,经分离纯化后的含量与AP均可达92%;由XRD、TG、LPSA、刚果红、微观结构等方面得出其在溶解度、黏度、物理性质等方面的改变有利于更好发挥生物活性,同时获得更好的加工特性。     

酶联免疫吸附试验检测禽脑脊髓炎抗体方法的研究

利用鸡胚成纤维细胞 (CEF)繁育禽脑脊髓炎病毒 (AEV) ,取其培养物 ,经差速离心提纯 ,做为酶联包被杭原 ,建立了检测AEV抗体的间接酶联免疫吸附试验 ,初步确定了各种反应条件 :抗原包被浓度 16 7μg/ml,待检血清 1∶10 0稀释 ,酶标抗体工作浓度 1∶5 0 0。以阴性血清OD值平均值加上 2个标准差作为界值 ,当待测样品OD值大于界值 0 2 7时 ,判为阳性 ,否则判为阴性。经交叉试验、阻断试验、重复试验和平行试验 ,证实了本试验建立的方法具有良好的特异性和重复性     

Prokaryotic Expression, Ascitic Polyclonal Antibody Preparation and Identification of Cashmere Goat Izumo1

Izumol is a novel member of the immunoglobulin superfamily locating on sperm, and is indispensable for sperm-egg fusion. According to its immunoglobulin-like domain in the extracellular region, Izumol was fractionated into 6 fragments (F0-F5) which were ligated with pGEX-4Tl to construct the prokaryotic expression vectors pGEX-Fn. The recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) and the GST-Fn fusion proteins were expressed successfully by induction with IPTG. GST-FO, a recombinant fusion protein of GST with the full length of extracellular region of mature cashmere goat Izumol, was purified by polyacrylamide gel slicing method and was used as an antigen to immunize the Kunming mouse to generate anti-GST-Izumo1 ascetic polyclonal antibody with intraperitoneal injection of SI80 cells. Subsequently, the anti-GST-Izumol polyclonal antibody was purified with miscellaneous antigen by glutaraldehyde cross-linking method. Western blotting analysis showed that the purified ascetic polyclonal antibody had high affinity to all 6 GST-Izumo1 fragment fusion proteins. Immunohistochemical analysis with this antibody displayed that the cashmere goat Izumol proteins were at the equatorial segment of sperm head surface. These results indicate that this polyclonal antibody has high specificity and lays the foundations for further study on the expression pattern of Izumol in cashmere goat testis and binding abilities of each extra-membrane fragment of Izumol to the egg surface.