猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白1α多克隆抗体的制备及应用

以真核质粒pcDNA3.1-flag-nsp1α为模板,利用PCR扩增出nsp1α基因片段,构建原核重组载体pET32a-nsp1α,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态,1 mmol/L IPTG在37℃诱导表达6 h,成功获得以包涵体形式存在的重组蛋白,能够与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体复性后作为抗原免疫新西兰大白兔,3次免疫后20 d获得兔多抗血清。通过间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光、免疫组化等试验获得了高效价的兔多抗血清,该血清能够特异性地识别真核质粒表达的nsp1α以及PRRSV BJ4株。该试验成功表达了pET32a-nsp1α重组蛋白,并制备了高效价、高特异性的兔抗nsp1α多克隆抗体。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T A vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET A vp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET A vp1的E. coli BL21 (DE3) 菌后,SDS PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29 ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37 ℃条件下,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达6 h后,VP1蛋白的表达量最大。Western Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。     

猪IFN-α8的原核表达及抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性研究

为确定猪干扰素α8(poIFN-α8)蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的抗病毒作用，合成poIFN-α8基因，克隆入pCSMH大肠杆菌表达载体，将重组表达载体转化DH5α感受态细胞，进行温度诱导表达后，收集菌体进行SDS-PAGE电泳。将表达的目的蛋白利用Ni-琼脂糖凝胶纯化柱纯化后，采用Western blot试验检测重组poIFN-α8的反应原性，利用猪肺泡巨噬细胞（PAM）检测0.01、0.05、0.1、1 ng/mL的重组poIFN-α8蛋白对PRRSV的抗病毒活性，并检测重组poIFN-α8蛋白对下游干扰素刺激基因（ISG）Mx1、OAS1、ISG15的诱导激活作用。结果表明，成功构建了pCSMH-IFN-α8表达载体，实现了poIFN-α8在大肠杆菌中的包涵体表达，且重组poIFN-α8蛋白具有良好的反应原性；0.05 ng/mL的重组poIFN-α8蛋白可显著抑制PRRSV在PAM中的复制，poIFN-α8的抗病毒效果显著优于猪干扰素α2(poIFN-α2)、猪干扰素α5(poIFN-α5)，且重组poIFN-α8能有效激活ISG的表达。综上，表达的重组poIF...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp7蛋白的表达与纯化

为了解nsp7重组蛋白的免疫学活性,采用RT-PCR的方法从猪繁殖与呼吸道综合症病毒(PRRSV)BJ-4毒株中扩增得到nsp7基因,将基因连接到pET-28a载体并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达,利用Ni-NTA进行亲和纯化,通过SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行分析和鉴定,通过间接ELISA方法研究了重组蛋白的免疫学活性。结果表明,成功制备了nsp7重组蛋白,间接ELISA结果表明,重组蛋白具有良好的免疫活性,为建立nsp7特异性抗体的间接ELSIA检测方法及PRRS诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株M基因的原核表达与重组蛋白的复性研究

采用PCR方法从重组质柱pTG19-T-M扩增得到缺失N端疏水区序列的基因片段tM.将tM与原核表达载体pET-32a进行连接并转化,重组质粒经鉴定并测序.结果表明,目的基因在大肠杆菌BL21细胞中成功地表达了醉繁殖与呼吸病毒重组蛋白pET-tM.表达量为31%.表达产物经SDS-PAGE分析,得到分子量约为29 kD的重组蛋白且以包涵体形式存在.8 mol·L~(-1)尿素变性溶解包涵体,再用稀释与透析相结合的方法对重组蛋白进行复性.复性蛋白经Western-blot检测,结果证明复性蛋白可被PRRSV阳性血清识别用.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株GP4蛋白的原核表达与纯化

【目的】原核表达和纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的结构蛋白GP4,为深入了解其结构和功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增PRRSV BJ-4株ORF4基因片段,将其克隆到pMD19-T载体中并进行测序。从测序正确的重组质粒pMD19-T-ORF4中扩增缺失N端及C端疏水序列的基因片段tGP4(truncated GP4),再将其亚克隆到pET-32a载体并转化到大肠杆菌BL21,IPTG进行诱导表达。对表达的重组蛋白进行可溶性分析,使用尿素梯度法进行蛋白纯化,并通过ELISA法检测重组蛋白的免疫活性。【结果】RT-PCR获得了537bp的ORF4。成功构建了原核表达载体pET-32a-tGP4,在IPTG诱导后重组蛋白以包涵体的形式大量表达。使用尿素梯度法获得了纯度较高的目的蛋白,纯化的目的蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合。【结论】使用原核细胞成功表达了PRRSV的结构蛋白GP4,纯化后的重组蛋白具有很好的免疫原性。     

猪流行性腹泻病毒流行毒株COE基因的原核表达及免疫原性分析

应用RT-PCR方法从PEDV流行毒株中扩增COE基因,并将其克隆至原核表达载体pET-32a,构建pET-32a-COE重组质粒。将重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,该重组蛋白获得了表达,主要以包涵体形式存在,分子量约为35.5 ku;Western-blot分析结果显示,所表达的重组蛋白能与抗PEDV小鼠血清反应。应用纯化的重组蛋白加入弗氏佐剂免疫6周龄BALB/C小鼠并采集血清,ELISA检测抗体效价达1∶3 200以上,说明所表达的蛋白具有良好的免疫原性。     

重组蛋白sHLA-G1的原核表达与纯化

为了进一步在蛋白质水平对人白细胞抗原HLA-G进行分析,利用已经构建好的克隆质粒pGEM-T-HLA-G1,进一步构建了重组原核表达质粒pET28a-sHLA-G1。SDS-PAGE检测表明,重组蛋白sHLA-G1在大肠杆菌(E.coli)中得到稳定表达,原核表达的重组蛋白sHLA-G1主要以包涵体形式存在。包涵体蛋白经充分洗涤、尿素溶解后用钴离子树脂纯化,并用SDS-PAGE和Western印迹进行了分析,鉴定结果表明,该蛋白纯度达到90%以上,并能与HLA-G特异性抗体87G反应。该研究结果为进一步的复性工作奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S-1株GP5蛋白和N蛋白的原核表达

将构建好的表达质粒pET-E和pET-N转化到大肠杆菌BL-21中,通过诱导剂IPTG的诱导,在原核表达系统中得到了高效表达,重组蛋白的分子量分别为39 KDa和31 KDa左右。通过Western-blot蛋白免疫印记法检测蛋白活性,发现两种原核表达重组蛋白均能与PRRSV阳性血清发生反应,具有生物学活性,这就为下一步目的蛋白的纯化、蛋白高级结构的研究以及以GP5和N蛋白为抗原ELISA诊断方法的建立奠定基础。     

猪细环病毒1型衣壳蛋白的原核表达及鉴定

为了制备猪细环病毒1型(TTSuV1)抗体,并为建立TTSuV1免疫学检测方法奠定基础。用PCR技术扩增TTSuV1衣壳蛋白(Cap)基因片段,与载体pET-32a定向连接,构建重组原核表达质粒pET-32a-Cap,转化入大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导重组阳性菌表达,SDS-PAGE研究融合蛋白表达情况。对重组融合蛋白进行纯化、复性后,免疫BALB/c小鼠4次来制备鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体。分别以鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体和TTSuV1猪阳性血清为一抗,对重组融合蛋白进行免疫印迹检测。结果显示,成功表达了TTSuV1Cap截短体融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在,重组蛋白可与鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体及TTSuV1猪阳性血清发生特异性结合,表明表达的TTSuV1-Cap融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。     

口蹄疫病毒3D蛋白C端Th表位的重组表达及免疫功能鉴定

为获得含有口蹄疫病毒( foot and mouth disease virus,FMDV)3D蛋白C端多个Th表位的重组表达蛋白，根据口蹄疫3D C端160个氨基酸序列，设计优化并人工合成相应的核酸序列，将其克隆至pET28a，构建原核表达质粒pET28a C160，并将重组质粒转化BL21(DE3)，0.5 mmol/L IPTG诱导后，收集菌液进行SDS PAGE和Western blot鉴定。结果显示，在25 ku处有一条明显的蛋白表达条带，且重组蛋白能与豚鼠抗O型口蹄疫病毒阳性血清发生特异性反应。对表达产物进行可溶性分析，结果显示，表达蛋白全部以包涵体形式存在，经变复性后获得较高质量浓度的纯化蛋白。可见：用纯化的3D C160蛋白作为Th佐剂与口蹄疫主抗原混合制成疫苗，免疫后能刺激猪体产生较高水平的口蹄疫抗体。     

缺失α1螺旋的Cry1Ac在大肠杆菌中的表达、纯化和活性分析

[目的]对缺失α1螺旋的Cry1Ac在大肠杆菌中的表达、纯化和活性进行分析。[方法]以苏云金芽孢杆菌HD-1中的质粒为模板,扩增缺乏α螺旋的Cry1Ac基因,并将其与pET28a载体连接,构建重组质粒。重组质粒转化并经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。提取目标蛋白,并涂在棉铃虫饲料表面,检测其杀虫活性。[结果]Cry1Acdelα1基因在大肠杆菌中能正常表达目标蛋白,但该目标蛋白是以包涵体形式存在。生侧结果显示,在相同浓度下,活化的Cry1Ac对棉铃虫的致死率达75%以上,而Cry1Acdelα1只有10%左右。[结论]用大肠杆菌表达的Cry1Acdelα1对棉铃虫基本没有杀虫活性。     

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)核衣壳蛋白的克隆、表达与免疫印迹

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白(N蛋白)基因克隆到原核表达载体pET-28α( )中,得到重组质粒pET-PRRSV/N,并转化入受体菌BL21中.转化子经IPTG诱导表达4 h后,表达蛋白量达到高峰.经15%SDS-PAGE电泳检测和经Western blotting分析,表达蛋白大小约为17 kD,符合预期结果,并能与PRRSV阳性血清发生特异性反应,而不与阴性血清反应.这说明表达蛋白具有高度免疫反应特异性.     

缺失α1螺旋的Cry1Ac在大肠杆菌中的表达、纯化和活性分析(英文)

[目的]对缺失α1螺旋的Cry1Ac在大肠杆菌中的表达、纯化和活性进行分析。[方法]以苏云金芽孢杆菌HD-1中的质粒为模板,扩增Cry1Ac基因,并将其与pET28a载体连接,构建重组质粒。重组质粒转化并经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。提取目标蛋白,并涂在棉铃虫饲料表面,检测其杀虫活性。[结果]Cry1Acdelα1基因在大肠杆菌中能正常表达目标蛋白,但该目标蛋白是以包涵体形式存在。生测结果显示,在相同浓度下,活化的Cry1Ac对棉铃虫的致死率达75%以上,而Cry1Acdelα1只有10%左右。[结论]用大肠杆菌表达的Cry1Acdelα1对棉铃虫基本没有杀虫活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析

[目的]在基因工程菌中实现猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7基因的高效表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其免疫学活性及应用价值。[方法]将已构建好的重组表达载体pET-ORF7转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG在最适条件下诱导表达,其表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行检测。应用Ni-NTAHis.Bind Resin层析柱在变性条件下纯化表达产物,通过梯度透析进行复性。采用Western Blot及间接ELISA法检测复性后重组蛋白的免疫学活性。[结果]重组质粒pET-ORF7在大肠杆菌中以融合形式成功表达,融合表达产物主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE检测所表达的重组蛋白分子量为33 kD左右,与预期大小相符。Band-scan软件对表达蛋白分析发现,表达产物约占菌体蛋白的50%。Western Blot及间接ELISA法显示复性后的重组蛋白与PRRSV阳性血清有特异性结合反应,表明其具有良好的免疫学活性。[结论]该试验将为进一步研制PRRSV单克隆抗体及诊断试剂盒奠定基础。     

分子伴侣对A型FMDV结构蛋白VP1在大肠杆菌中可溶性表达的促进作用

为获得具有活性的A型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1蛋白,以重组质粒pUC57-MM-VP1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV VP1基因片段,并将该片段插入原核表达载体pET-28a构建重组质粒pET-28a-MM-VP1;之后将该质粒转入E.coli BL21(DE3)进行诱导,同时对诱导温度进行了优化。SDSPAGE显示,最佳诱导温度为18℃,VP1蛋白主要以包涵体形式高效表达;为了提高VP1蛋白可溶性表达,将重组质粒pET-28a-MM-VP1与pTF16共同转入E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,并对表达条件进行优化。结果表明,分子伴侣有效提高了A-VP1重组蛋白的可溶性表达量,诱导最佳条件为18℃、0.1 mmol·L~(-1)IPTG、2 g·L~(-1)阿拉伯糖、诱导时间20 h。Western-Blot结果表明,得到的重组蛋白能够被抗FMDV的阳性血清识别,反应原性良好。     

卵形鲳鲹 JAK3 蛋白的原核表达与纯化

【目的】纯化获取卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)JAK3(TroJAK3)重组蛋白,为了解TroJAK3蛋白功能、相互作用及抗体制备奠定基础。【方法】应用分子生物学技术构建重组质粒pET-32a-TroJAK3,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测TroJAK3重组蛋白表达情况。【结果】PCR扩增片段长度为3 333 bp,经双酶切鉴定、测序确认序列和开放阅读框正确,结果显示成功构建重组质粒pET-32a-TroJAK3。经终浓度为1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h后进行SDS-PAGE检测,结果表明TroJAK3重组蛋白以包涵体形式大量表达,分子量约为140 ku。经Ni-IDA树脂柱纯化,获得纯化的重组蛋白。Western blot检测结果显示有140 ku的条带,表明TroJAK3重组蛋白能被抗His抗体识别。【结论】成功构建了重组质粒pET-32a-TroJAK3,纯化得到高纯度的TroJAK3融合蛋白。     

PRRSV细胞受体CD163 SRCR5-SRCR6多克隆抗体的制备

【目的】制备鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体CD163SRCR5-SRCR6多克隆抗体。【方法】提取PAM细胞总RNA,通过RT-PCR方法获得CD163SRCR5-SRCR6(第1 417~2 136bp,共720个bp)基因,将其克隆到pET-28a(+)载体上,构建重组表达载体pET-28a(+)-CD163,经酶切、PCR鉴定和测序验证后转化大肠杆菌,在BL21(DE3)中诱导重组目的蛋白表达,然后用Ni-NTA方法纯化目的蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA和IFA方法检测多克隆抗体效价,并初步鉴定多克隆抗体血清结合细胞及阻断PRRSV感染细胞的活性。【结果】克隆了720bp的CD163SRCR5-SRCR6基因,成功构建了pET-28a(+)-CD163重组表达载体;SDS-PAGE结果表明,CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白被成功诱导并以包涵体形式表达;Western blot结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性,间接ELISA方法测得免疫Balb/c小鼠制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体效价可达105;IFA试验结果显示,制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体可与Marc-145细胞结合,且在1∶20、1∶40倍稀释时,能部分阻断高致病性PRRSV SD16毒株感染Marc145细胞。【结论】用大肠杆菌原核表达系统成功诱导表达了CD163SRCR5-SRCR 6重组蛋白,用重组蛋白免疫小鼠获得了高效价多克隆抗体,其可以结合细胞并阻断PRRSV感染细胞。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因的原核表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M基因序列设计2对引物,通过PCR扩增得到了PRRSV M基因的全长片段和N-末端截短67个氨基酸序列的MNd67基因片段,分别将这些片段插入到表达质粒pET-28a(+)的多克隆位点上构建重组表达质粒,PCR、酶切及测序鉴定表明,成功构建了2种重组表达质粒(pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67)。重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)后利用α-乳糖诱导其表达,SDS-PAGE电泳分析表明,E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV MNd67成功表达分子质量为14ku的重组蛋白,而E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV M未见明显的表达蛋白。试验结果表明已成功表达截短的PRRSV M蛋白,可为PRRSV诊断抗原和疫苗研究奠定基础。     

猪α、γ干扰素的原核表达、纯化及抗病毒活性初步研究

提取猪白细胞DNA、猪脾脏RNA,特异性引物扩增猪IFN-α、IFN-γ基因,将IFN-α和IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ,转化大肠杆菌B121,在IPTG诱导下表达猪IFN-α及IFN-γ,SDS-PAGE分析重组表达蛋白;用细胞病变抑制法检测重组表达蛋白的抗病毒活性.结果表明成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ;SDS-PAGE可检测到相对分子质量为21.3 Ku和19.4 Ku的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在;经Ni2+-NTA亲和层析纯化,获得高纯度重组蛋白;纯化的猪IFN-α和IFN-γ抗星状病毒复制的活性分别为3.15×103 U·mg-1和2.48×103 U·mg-1.