红鳍东方鲀去乙酰化酶SIRT3基因的克隆及原核表达

从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肝脏组织中提取总RNA,通过RT–PCR扩增,获得SIRT3基因的编码阅读框(ORF),用原核表达载体p ET32a(+)构建p ET32a/SIRT3重组质粒,用异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)将重组质粒p ET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示,红鳍东方鲀SIRT3基因(tr SIRT3)ORF区大小为1 263 bp大小,编码420个氨基酸。经IPTG诱导表达后,获得1个带组氨酸(His)标签的融合蛋白,目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了相对分子质量约66 000的重组蛋白。     

红鳍东方鲀FoxO1基因的原核表达及纯化

采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总RNA,采用RT–PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀FoxO1基因的ORF,并构建其原核表达载体p ET–32/FoxO1,在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达,通过IPTG诱导表达,对重组FoxO1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定,结果表明:重组质粒p ET32a/FoxO1被成功构建;用IPTG进行诱导表达,融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应;纯化出了融合表达蛋白,获得了相对分子质量约为110 000的重组蛋白。     

SUMO-β-抑制蛋白2融合基因的克隆、表达与蛋白纯化

2型糖尿病是一种常见的慢性疾病,其发生与胰岛素的耐受相关。β-抑制蛋白2(β-arrestin2)的缺失或功能紊乱,会导致胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生。而使用β-arrestin2进行治疗可明显缓解葡萄糖不耐受及胰岛素抵抗。本研究通过重组PCR方法,将小分子泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)与β-arrestin2基因融合,再将融合基因插入原核表达载体p ET22b中,成功构建了p ET22b-SUMO-β-arrestin2表达载体,将重组表达载体转入大肠杆菌Rosetta Blue(DE3)宿主细胞,使用IPTG在温度为20℃诱导表达,再将诱导表达后的蛋白经Ni-NTA进行纯化,成功获得SUMO-β-arrestin2蛋白,为后续β-arrestin2药效学的研究奠定基础。     

DSM–18020菌株expI基因的克隆及生物信息学分析

为克隆和研究软腐病菌Dickeya dadantii的信号分子合成酶基因expI,从Dickeya属模式菌DSM–18020的基因组中扩增获得了基因expI。生物信息学分析显示,该基因全长639 bp,与Dickeya dadantii 3937的N–酰基高丝氨酸内酯(N–acyl–homoserine lactone,AHLs)合成酶基因同源性达99%;DSM–18020 expI编码的蛋白质相对分子质量为24 704,理论等电点为5.85,整个肽链中均匀分布疏水氨基酸,且比亲水性氨基酸多,没有信号肽存在;将获得的exp I基因构建到表达载体p ET–28α(+)并转入大肠杆菌BL21(DE3),诱导后的表达产物与理论值一致。     

杜氏盐藻促有丝分裂活化蛋白激酶DsMAPK的原核表达及纯化（英文）

盐藻是研究植物耐盐机制的重要模式生物,而MAPK基因在植物耐盐分子途径中起重要作用。该试验通过PCR扩增Ds MAPK基因的开放阅读框(ORF),并将其克隆至带有GST标签的原核表达载体p GS-21a,得到重组表达载体p GS-21a-MAPK。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,然后对融合蛋白进行表达形式分析,利用GSTSefinoseTMKit进行纯化,所得产物进行SDSPAGE和Western blot鉴定。结果表明,该试验成功构建了重组表达载体p GS-21a-MAPK,经IPTG诱导后表达的融合蛋白与预期相符,纯化后的上清蛋白经Western blot检测显示该融合蛋白能与抗GST单克隆抗体特异性结合,具有良好的免疫学活性,Ds MAPK的成功表达为进一步在蛋白质水平上研究其在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Erp蛋白PGLTS的4基序突变体的构建

以结核分枝杆菌H37Ra DNA为模板,通过PCR扩增,获得靶基因erp片段。采用重叠延伸PCR的方法得到erp基因PGLTS的4基序的突变体,依次删除突变体的C-末端、N-末端和C/N-端,构建重组质粒p ET28a-C4、p ET28a-N4、p ET28a-CN4,转化BL21(DE3)p Lys S。对重组菌株IPTG诱导后的表达产物进行Tricine SDS-PAGE,得到大小分别约为11.2、15.4、4.8 ku的目的蛋白。Western blotting分析结果表明,目的蛋白表达特异。     

罗氏沼虾GIH–like基因的克隆与原核表达

运用RT–PCR技术获得罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii) GIH–like基因的开放阅读框(ORF)序列，通过荧光定量PCR技术检测该基因在罗氏沼虾不同组织中的表达量，并运用原核表达技术诱导表达罗氏沼虾GIH–like成熟肽的重组蛋白。结果显示：罗氏沼虾GIH–like的ORF全长为339 bp，共编码112个氨基酸残基，其中包含34个氨基酸组成的信号肽及78个氨基酸组成的成熟肽，具有CHH家族Ⅱ型肽的典型特征；同源性和进化关系分析表明，罗氏沼虾GIH–like与日本沼虾GIH的同源性最高，亲缘关系最近；荧光定量PCR结果显示，罗氏沼虾GIH–like在眼柄中的表达量最高，极显著(P<0.01)高于其他组织的，在脑、神经节、心脏等组织中表达量较低；诱导表达的罗氏沼虾GIH–like重组蛋白的相对分子质量约为2.6×10⁴，除去标签蛋白后约为8.5×10³，与Prot Param预测的9.4×10³接近。     

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。     

结核分枝杆菌酯酶Rv1400c原核表达及表达产物的酶活性分析

为探究结核分枝杆菌酯酶Rv1400c活性,以进一步研究Rv1400c的结构和功能。以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,对Rv1400c基因进行扩增,并将其克隆到p ET28b(+)原核表达载体上,构建p ET28b-Rv1400c重组质粒,然后将构建的重组质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,增菌后用IPTG进行诱导表达再用亲和层吸树脂法进行纯化,利用不同底物、不同p H、不同温度对纯化后的Rv1400c酯酶进行活性分析。结果表明:成功构建出p ET28b-Rv1400c重组质粒;SDS-PAGE和Western blot显示,Rv1400c以包涵体形式表达,蛋白分子质量为39 ku;在对8种底物的筛选中发现Rv1400c在C2~C14中具有活性,其中以在C2中活性最好;在以C12为底物、p H 8.0、37℃条件下酯酶活性最高。     

鸭坦布苏病毒囊膜蛋白抗原表位的串联表达与抗原性分析

在对鸭坦布苏病毒囊膜蛋白抗原表位分析的基础上,将已经筛选出的8条抗原性良好的多肽采用柔性肽拼接,转入T载体中。将酶切回收的串联基因(命名为TEM)克隆于表达载体p ET32a中,获得重组表达质粒p ET32a-TEM,将该质粒转化于感受态细胞BL21(DE3)中,经IPTG诱导后进行超声裂解,对融合蛋白进行可溶性分析、Western blotting分析和免疫原性分析。重组质粒p ET32a-TEM的酶切和测序结果表明,TEM串联基因已成功插入到p ET32a原核表达载体中;表达的p ET32a-TEM融合蛋白分子质量约为38 000,以包涵体形式存在。Western blotting和小鼠免疫试验结果显示,p ET32a-TEM融合蛋白与鸭坦布苏病毒阳性血清能发生特异性反应,具有良好的抗原性。串联多肽的成功表达,将为鸭坦布苏病血清学检测方法建立、新型工程疫苗的研发奠定基础。     

陆地棉锌指蛋白(GZFP)的原核表达

采用大肠杆菌表达体系来获得陆地棉锌指蛋白(GZFP)的融合蛋白.以pMD18-GZFP质粒为模板,用PCR方法扩增获得GZFP基因的编码区序列,将其克隆到表达载体pET28b(+)中,转化宿主菌BL21(DE3),成功地构建了陆地棉GZFP基因原核表达载体pET-GZFP、经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析和蛋白质杂交检测表明,陆地棉GZFP以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到大量表达.     

猪伪狂犬病毒gB和gC蛋白B细胞表位编码序列的融合表达及活性测定

依据猪伪狂犬病毒g B和g C蛋白的B细胞表位编码序列,分别设计g B和g C蛋白B细胞表位编码序列的融合扩增引物,利用融合PCR技术,将g B和g C蛋白B细胞表位编码序列有机地融合为g B-C表位编码序列。将融合基因片段插入到原核表达载体p ET28a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白g B-C能够高效表达,重组蛋白的分子质量约为38 ku;经Western blot鉴定分析,小鼠抗His标签单克隆抗体和PRV阳性血清均能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了融合蛋白g B-C,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。     

拟南芥IAA7的原核表达及稳定性分析

以p GEX–KG为基本骨架,构建了拟南芥IAA7蛋白的原核表达载体,用IPTG诱导IAA7在3种大肠杆菌表达菌株Rosetta、BL21和Tuner中表达,利用GST SefiroseTM resin亲和树脂分离纯化GST–IAA7融合蛋白,并分析重组蛋白在体外保存时的稳定性。结果表明:GST–IAA7融合蛋白在Rosetta菌株中于25℃和0.4 mmol/L IPTG诱导下表达较好;蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)可显著延长GST–IAA7在体外保存的时间,最后利用凝血酶切除GST标签后获得了纯化的IAA7蛋白质。     

杜氏盐藻促有丝分裂活化蛋白激酶 DsMAPK的原核表达及纯化

盐藻是研究植物耐盐机制的重要模式生物,而 MAPK基因在植物耐盐分子途径中起重要作用。该试验通过PCR扩增DsMAPK基因的开放阅读框（ORF）,并将其克隆至带有GST标签的原核表达载体 pGS-21a,得到重组表达载体pGS-21a-MAPK。将重组表达载体转化 E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,然后对融合蛋白进行表达形式分析,利用 GST-SefinoseTM Kit进行纯化,所得产物进行 SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果表明,该试验成功构建了重组表达载体 pGS-21a-MAPK,经IPTG诱导后表达的融合蛋白与预期相符,纯化后的上清蛋白经 Western blot检测显示该融合蛋白能与抗 GST单克隆抗体特异性结合,具有良好的免疫学活性, DsMAPK的成功表达为进一步在蛋白质水平上研究其在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基础。     

陆地棉锌指蛋白(GZFP)的原核表达

采用大肠杆菌表达体系来获得陆地棉锌指蛋白（GZFP）的融合蛋白．以pMD18-GZFP质粒为模板,用PCR方法扩增获得GZFP基因的编码区序列,将其克隆到表达载体pET28b（＋）中,转化宿主菌BL21（DE3）,成功地构建了陆地棉GZFP基因原核表达载体pET—GZFP、经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析和蛋白质杂交检测表明,陆地棉GZFP以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到大量表达．     

绵羊痘病毒多表位基因的构建及原核表达

通过计算机软件筛选出绵羊痘病毒基因组中心编码区的ORF90核蛋白、ORF112融合蛋白、ORF117糖蛋白、ORF55膜蛋白和基因组末端的ORF134宿主范围相关基因的6段T、B细胞优势抗原表位,以柔性氨基酸(GPGPG)作为接头,串联合成1条全新的多表位嵌合基因mE,将其克隆到原核表达载体pET-32中,采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒,构建pET32-mE质粒;用IPTG在不同条件下诱导表达,确定最佳表达条件,表达产物经SDS-PAGE分析。结果表明,重组蛋白是分子质量为41ku的融合蛋白。在IPTG浓度为0.5mmol/L,温度为37℃、诱导4h时目的蛋白的表达量最大,约占菌体的32%。Western-blotting试验表明,目的蛋白可被羊痘血清识别。     

家蚕核型多角体病毒ORF 75基因的克隆及表达

根据GenBank发表的序列(L33180)设计引物,利用PCR技术扩增了编码家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)ORF75基因的DNA片段,将其连接至pMD18-T载体上,获得了该基因成熟蛋白阅读框序列.利用设计的酶切位点将目的基因从克隆载体上切下.表达质粒pGEX-4T-2经BamHI/XhoI双酶切,与目的片断连接,得到重组表达质粒pGEX/Bm75.将重组表达质粒pGEX/Bm75转化入大肠杆菌BL 21中,经IPTG诱导表达后,12%SDS-PAGE分析表明产生57 kDa左右的特异蛋白质条带.对表达产物进行Westernblotting分析,结果表明,pGEX/Bm75经IPTG诱导产生的57 kDa蛋白条带与抗体发生了很强的交叉反应,融合蛋白得到了表达.     

玉米象线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因克隆与表达分析

【目的】克隆辣根素可能的作用位点——细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ(COXⅢ)的全长cDNA,并对其进行序列分析及原核表达。【方法】在NCBI数据库中查找玉米象(Sitophilus zeamais)COXⅢ已知的部分序列,利用RT-PCR,结合RACE技术克隆获得玉米象COXⅢ全长序列;利用DNAMAN8.0、MEGA5.1、GENEDOC、Prot Param和Target P 1.1 Server等软件对该基因全长cDNA序列、系统进化关系、基本理化性质及其三维结构进行分析;将玉米象COXⅢ基因分别与载体p EASY-Blunt E1、pET28a、pET30a、p ET32a、pET42a连接,构建原核表达载体p EASY-Blunt E1-COXⅢ、pET28a-COXⅢ、pET30a-COXⅢ、p ET32a-COXⅢ、pET42a-COXⅢ并分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,在不同IPTG诱导浓度、温度以及时间内诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot(WB)对表达结果进行验证。【结果】获得的玉米象COXⅢ基因全长cDNA序列开放阅读框(ORF)为792 bp,编码263个氨基酸,编码的蛋白分子质量约为30 938.1 Da,理论等电点p I 6.51,预测分子式为C1492H2154N338O362S10,不稳定系数为34.49,总平均亲水系数为0.492,为疏水的稳定蛋白。系统发育树显示玉米象与鞘翅目象鼻虫科昆虫米象进化关系最近。原核表达结果表明,该蛋白在18℃、1 mmol·L-1 IPTG诱导24 h的条件下即能实现融合蛋白的表达,可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blot印迹检测证实大肠杆菌BL21(DE3)中表达了一个分子量约为62 k D的融合蛋白。【结论】成功从玉米象昆虫克隆得到COXⅢ全长cDNA序列,并实现了其编码蛋白的原核表达,可为后续探究玉米象COXⅢ功能和异硫氰酸酯类化合物对玉米象的作用机理提供理论依据。     

水稻OsV3IP2和OsV3IP3原核表达与鉴定

通过生物信息学分析确定OsV3IP2和OsV3IP3的可溶性肽段,获得可溶性的OsV3IP2和OsV3IP3外源表达蛋白质,将相应的编码区克隆于原核表达载体p ET32a中,进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白质。结果表明,利用生物信息学软件对蛋白质的二级结构进行预测,将OsV3IP2、OsV3IP3分别分为2个和4个部分。将其分别克隆到p ET32a后,采用0.2 mol/L IPTG在10、20、30℃诱导表达。经SDS-PAGE和Western Blot分析,证明OsV3IP2-1、OsV3IP 2-2、OsV3IP 3-1表达的融合蛋白存在于上清液中,而OsV3IP 3-2、OsV3IP 3-3表达的融合蛋白存在于沉淀中,获得了OsV3IP2-1、OsV3IP 2-2、OsV3IP 3-1可溶性目的蛋白,为进一步体外验证OsVDAC3与OsV3IP2、OsV3IP3的互作奠定了基础。     

香蕉MaASR1基因的生物信息学分析及原核表达

为了深入研究MaASR1基因的分子生物学功能,利用RT-PCR技术从拟南芥转基因株系L14中克隆到MaASR1基因的cDNA序列,该序列含有1个432 bp的开放阅读框,编码143个氨基酸的蛋白质,并对该序列进行了生物信息学分析。将该基因克隆到原核表达载体PET-30a中,经酶切和测序鉴定后,将正确的重组质粒p ET30aMaASR1导入大肠杆菌BL21(DE3),成功构建了该基因的原核表达载体。利用所构建的原核表达载体进行原核表达,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测,结果表明表达蛋白质与预期蛋白质大小基本一致。利用Ni柱亲和层析方法进一步获得了纯度较高的重组蛋白质,并用Western blot方法确定此重组蛋白质为目的蛋白质。