红鳍东方鲀去乙酰化酶SIRT3基因的克隆及原核表达

从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肝脏组织中提取总RNA,通过RT–PCR扩增,获得SIRT3基因的编码阅读框(ORF),用原核表达载体p ET32a(+)构建p ET32a/SIRT3重组质粒,用异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)将重组质粒p ET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示,红鳍东方鲀SIRT3基因(tr SIRT3)ORF区大小为1 263 bp大小,编码420个氨基酸。经IPTG诱导表达后,获得1个带组氨酸(His)标签的融合蛋白,目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了相对分子质量约66 000的重组蛋白。     

红鳍东方鲀白介素15的原核表达及其活性测定

为了开发红鳍东方鲀Takifugu rubripes免疫基因及其重组表达,生产重组免疫因子蛋白,通过提取红鳍东方鲀肾脏组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到白介素15(interleukin15,IL15)基因序列,将IL15成熟肽序列与原核表达载体p ET-32a(+)连接,成功构建重组表达载体(重组子)p ET-32a(+)-IL15,并将其重组子转化至Escheria coli BL21(DE3)感受态细胞中获得重组表达IL15的基因工程菌,再经IPTG诱导,p ET-32a(+)-IL15在BL21中得到了融合表达。结果表明:通过对表达产物的纯化和Western Blotting检测,红鳍东方鲀IL15在大肠杆菌中的表达量较高,蛋白浓度为294.6μg/m L;用MTT法对该蛋白进行活性鉴定显示,加入稀释10倍和100倍的重组红鳍东方鲀IL15蛋白时,CTLL-2细胞的增殖率相对较高,分别为71%和73%。研究表明,重组红鳍东方鲀IL15蛋白具有体外促进CTLL-2细胞增值的能力。     

红鳍东方鲀防御素db-1基因的原核表达分析

采用原核表达方法高效表达红鳍东方鲀Takifugu rubripes防御素db-1基因,并获得该基因的重组表达产物。通过RT-PCR扩增获得红鳍东方鲀防御素db-1基因成熟肽编码序列,将其连入pET32a+载体,构建原核表达载体pET32a-m DB-1,然后将其转入至大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的基因表达,通过SDS-PAGE和Western Blotting检测该蛋白,并利用Ni-NTA亲和层析纯化该蛋白,最后以Anti-Mus defensin Beta2抗体为探针的Elisa反应鉴定该蛋白。结果表明:红鳍东方鲀db-1基因在大肠杆菌中高效表达,并纯化得到了这种重组防御素融合蛋白。本研究中提供了一种简单、高效获取重组防御素蛋白的方法,可为其应用和生产提供支持。     

红鳍东方鲀Sirt1基因的克隆及其原核表达

【目的】克隆红鳍东方鲀Sirtuin1(Sirt1)基因编码阅读框(ORF),并对其进行原核表达。【方法】采集红鳍东方鲀脂肪组织,提取其总RNA,采用RT-PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF,构建其原核表达载体pET32a/Sirt1,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。【结果】红鳍东方鲀Sirt1基因ORF区由2 070个核苷酸组成,编码689个氨基酸。根据红鳍东方鲀Sirt1ORF核苷酸序列推测的氨基酸序列与其他物种进行比对,发现其与罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲齿鲤(Nothobranchius furzeri)、科恩氏假鳃鳉(Nothobranchius kuhntae)、斑马鱼(Danio rerio)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的同源性分别为82%,82%,81%,66%,72%和69%;成功构建了重组质粒pET32a/Sirt1,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约105ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】克隆得到红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF序列,并成功对其进行了原核表达。     

苎麻香豆酸–3–羟化酶基因的原核表达

以湘苎3号为材料,采用RT–PCR克隆,获得苎麻香豆酸–3–羟化酶(Bn C3H)基因的开放阅读框(ORF)序列,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体p ET–22b中,将构建成功的重组子p ET–22b–C3H转入BL21并诱导表达。结果显示:Bn C3H基因ORF区大小为1 536 bp,编码511个氨基酸,推测蛋白相对分子质量为57 800,理论等电点为8.61,编码的蛋白质为亲水性蛋白质;重组子在IPTG浓度为1 mmol/L时,融合蛋白的表达量在诱导2 h后达到最高,经IPTG诱导和SDS–PAGE检测,获得的融合蛋白与预期蛋白相符。     

红鳍东方鲀IgM重组表达与多克隆抗体制备

红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）是我国重要的海水养殖经济鱼类，探究红鳍东方鲀IgM的结构与功能对其病害防治与免疫系统的研究均有重要意义。本研究克隆获取了红鳍东方鲀IgM的重（H）链恒定（C）区序列，序列大小为1326bp，编码442个氨基酸，将获得的IgM序列连接至pET28a表达载体上，利用大肠杆菌BL21进行体外重组表达，SDS-PAGE结果显示：重组蛋白红鳍东方鲀IgM（TrIgM）大小约为62kDa，重组表达的IgM主要以包涵体形式表达。通过体外复性获得可溶性TrIgM蛋白, 将制备的TrIgM蛋白免疫BALB/c小鼠，获得了TrIgM鼠抗血清，Western blot检测结果表明：制备的鼠抗血清可以与重组TrIgM蛋白和红鳍东方鲀天然血清中的IgM的重链蛋白特异性结合。本研究中制备的抗血清可作为检测红鳍东方鲀IgM的特异性抗体，为红鳍东方鲀相关免疫检测提供基础。     

红鳍东方鲀PPARγ真核基因表达载体构建及亚细胞定位研究

[目的]旨在克隆红鳍东方鲀PPARγ基因的cDNA,并通过构建真核表达载体pCMV-3Tag-4A-PPARγ,分析myc-PPARγ融合蛋白在大鼠L6细胞的表达及亚细胞定位。[方法]利用RT-PCR技术克隆红鳍东方鲀PPARγ基因的cDNA,构建pCMV-3Tag-4A-PPARγ重组质粒,转染至大鼠L6细胞,共聚焦显微镜下观察myc-PPARγ的亚细胞定位。[结果]红鳍东方鲀PPARγ基因cDNA ORF全长1557 bp,共编码518个氨基酸,pCMV-3Tag-4A-PPARγ融合蛋白在大鼠L6细胞核中表达,为深入探讨鱼类PPARγ生物学功能奠定了基础。     

牛樟芝se原核表达载体构建及重组蛋白的表达、纯化

鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)是多数中草药植物、药用菌中三萜合成途径中的限速酶,能影响三萜含量的积累。构建了牛樟芝鲨烯环氧酶基因(se)原核表达载体,并进行其重组蛋白诱导表达条件优化。以牛樟芝c DNA为模板扩增se,纯化后将其克隆到p MD18-T载体上,筛选阳性克隆并将其连接到原核表达载体p ET28a,构建重组质粒p ET-28a-se,经酶切验证后转化E.coil BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,利用L9(34)正交试验优化目的蛋白诱导表达条件及纯化。结果表明,不同正交处理间的蛋白表达差异显著(P0.05),其诱导因素的主次为时间温度IPTG浓度,诱导时间对重组蛋白表达影响最显著(P0.05)。而IPTG浓度和温度对重组蛋白表达影响并不显著(P0.05),且当IPTG终浓度为0.2 mmol/L,诱导时间为7 h,诱导温度为26℃时,对SE重组蛋白的诱导效果最佳。     

鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5的原核表达及特性分析

通过在大肠杆菌中表达鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5对其纯化,并进行特性分析。根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS5基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR技术扩增得到全长NS5基因序列,并将其定向克隆至原核表达载体p ET32a中,获得重组表达质粒p ET32a-NS5,经双酶切鉴定及测序正确后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白最终经SDS-PAGE及Western-blotting鉴定。结果显示,NS5融合蛋白分子质量约为120 ku,在诱导后5 h达到表达量高峰,融合蛋白以包涵体形式存在,Western-blotting显示原核表达的蛋白可被兔抗鹅坦布苏病毒血清特异性识别,表明以NS5蛋白为抗原制备的多克隆抗体具有较高的敏感性与特异性。     

牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白p7的克隆和原核表达纯化

为了对牛病毒性腹泻病毒(BVDV) p7蛋白进行表达和纯化,本研究开展p7基因克隆、原核表达载体构建和原核表达分析。依据GenBank数据库中BVDV毒株NADL的p7基因设计引物,以BVDV NADL的cDNA为模版,PCR扩增p7基因,测序鉴定后将其克隆至pCold-MBP原核表达载体中;优化蛋白诱导的IPTG浓度,过夜低温诱导p7蛋白表达,并使用Ni-TED琼脂糖树脂进行蛋白纯化。结果显示,成功克隆p7基因,与GenBank数据库中p7基因同源性100%;成功构建pCold-MBP-p7载体;IPTG浓度为1.2mM时诱导效果最佳;成功表达和纯化MBP-p7融合蛋白。结论:诱导表达纯化获得MBP-p7融合蛋白,为后续构建p7蛋白的多克隆和单克隆抗体提供重要的材料和平台。     

粪肠球菌Ace抗原表位预测及重组表位 疫苗载体构建与表达

利用生物信息学软件预测抗原表位,然后将筛选出的6个抗原表位基因片段分别与铁蛋白H亚基基因片段连接,并克隆到p ET-32a表达载体中,构建能融合表达Ace抗原表位和铁蛋白H亚基的重组质粒p ET-32aace1、p ET-32a-ace2、p ET-32a-ace3、p ET-32a-ace4、p ET-32a-ace5、p ET-32a-ace6,并经测序验证;优化诱导条件获得原核表达的重组蛋白后,用SDS-PAGE和Western Blot验证其相对分子质量大小和免疫原性;将重组蛋白进行纯化超滤,然后进行透射电镜成像检查。结果显示,本研究成功构建了7种原核表达载体;在IPTG诱导下获得了5种可溶性表达的融合蛋白,且均有较强的免疫原性;重组融合蛋白Ace1-H、Ace3-H、Ace5-H和Ace6-H在透射电镜下观察到了具有与天然铁蛋白类似的特殊中空结构,且其直径与天然铁蛋白纳米笼类似;而带多表位的重组蛋白Ace-H虽然也能自组装成纳米级颗粒,但没有中空核心,其直径也比天然铁蛋白略大。     

猪血管紧张素转化酶2重组蛋白诱导表达和纯化条件的优化

[目的]本文旨在探索猪血管紧张素转化酶2(ACE2)在大肠杆菌中最佳表达条件和纯化蛋白的最佳方法。[方法]将已构建好的猪重组表达载体p ET-32a-ACE2转染至大肠杆菌BL21(DE3),通过改变IPTG诱导浓度以及诱导时间来对诱导表达条件进行筛选,实现目的蛋白高效表达后选用Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法,对获得的重组猪p ET-32aACE2融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE和免疫印迹等分析鉴定表达产物。[结果]当IPTG浓度为1 mmol·m L-1、诱导时间为10 h时,ACE2蛋白在BL21(DE3)中表达量最高,以包涵体形式存在。表达产物的相对分子质量约为100×103,与预期目的蛋白大小相符。选用的Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法纯化重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体,均能得到可溶性的重组蛋白,但KCl染色切胶法纯化获得的可溶性重组蛋白浓度及纯度都更佳,纯化蛋白经Western blot鉴定具有良好的抗原性。[结论]本试验建立猪p ET-32a-ACE2重组蛋白诱导表达的最佳条件:IPTG浓度1 mmol·m L-1,诱导时间为10 h。并且以KCl染色切胶法纯化该重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体效果更好。     

生长素结合蛋白AtTIR1和IAA28的原核表达及纯化

以pGEX–KG为骨架,运用分子克隆方法构建了生长素结合蛋白AtTIR1和 IAA28的原核表达载体,通过转化不同表达菌株探索了2种蛋白的诱导表达条件。结果表明：在0.4 mmol/L IPTG诱导下,GST–IAA28融合蛋白在表达菌株Tuner中的表达量最高,其适宜诱导温度为16 ℃;在0.6 mmol/L IPTG诱导下,BL21(DE3)中GST–IAA28的表达量最高;在各种浓度的IPTG诱导下,Rosetta中的GST–IAA28的产量均不高;在25 ℃和0.4 mmol/L IPTG诱导条件下,Rosetta中的GST–AtTIR1表达总量最高,每克细菌可诱导出约0.2 mg的目标蛋白,但BL21(DE3)菌种中的GST–AtTIR1表达量很低。利用GST SefiroseTM resin亲和树脂对表达的蛋白进行纯化,获得了较纯的AtTIR1和IAA28蛋白。     

ShSAP1的原核表达及多克隆抗体的制备

将ShSAP1的阅读框连接到原核表达载体p ET32a(+)中,构建成ShSAP1原核表达载体PET-ShSAP1,然后将其转入宿主菌BL21,经IPTG诱导后,宿主菌表达出与预期分子量大小相符的35 ku的融合蛋白;将纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了ShSAP1的特异性抗血清;以融合蛋白作抗原,用间接ELISA法测定其抗血清效价为1∶25 000。     

柑桔黄龙病菌外膜蛋白的原核表达与纯化

为获得大量高纯度的柑桔黄龙病菌Omp 外膜重组蛋白、应用PCR 方法从染病柑桔模板中扩增出黄龙 病菌omp 基因的3 个片段、将其克隆到pMDl9-T 载体、再亚克隆到pET32a 原核表达载体、构建pET32a-omp 原核表 达重组质粒、然后转化大肠杆菌BL21（DE3）、经IPTG 诱导并用SDS-PAGE 电泳检测带组氨酸标签的Omp 融合蛋白 表达后、用镍柱分离纯化该融合蛋白。结果表明院柑桔黄龙病菌omp 基因序列的两个片段在37益经1 mmol/L IPTG 诱导后、在大肠杆菌得到了高效表达;镍柱纯化蛋白得到预期大小（约55 ku）的融合蛋白。     

拟南芥IAA7的原核表达及稳定性分析

以p GEX–KG为基本骨架,构建了拟南芥IAA7蛋白的原核表达载体,用IPTG诱导IAA7在3种大肠杆菌表达菌株Rosetta、BL21和Tuner中表达,利用GST SefiroseTM resin亲和树脂分离纯化GST–IAA7融合蛋白,并分析重组蛋白在体外保存时的稳定性。结果表明:GST–IAA7融合蛋白在Rosetta菌株中于25℃和0.4 mmol/L IPTG诱导下表达较好;蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)可显著延长GST–IAA7在体外保存的时间,最后利用凝血酶切除GST标签后获得了纯化的IAA7蛋白质。     

康氏木霉HEX1蛋白的原核表达及纯化

【目的】对康氏木霉HEX1蛋白进行原核表达和纯化,为进行抗体制备及深入研究HEX1功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增康氏木霉hex1基因,构建pMD19-T-hex1重组克隆质粒,在此基础上构建pET28a-hex1表达载体,转化E.coli BL21(DE3)细胞。通过IPTG诱导表达,对重组HEX1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定。【结果】成功克隆了长660bp的hex1基因并构建了融合表达载体,HEX1蛋白在IPTG诱导下得到表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应,并纯化出了融合表达蛋白。【结论】康氏木霉HEX1蛋白在原核细胞中得到成功表达及纯化,获得了分子质量约为25ku的重组蛋白。     

大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因设计引物,PCR扩增得到MCP基因编码框全长序列1 392 bp,将其克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-MCP,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,融合表达的重组蛋白分子量约为70 ku,与预期大小一致,主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度,诱导温度等诱导表达条件进行优化,确定0.5 mmol/L的IPTG于37℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化GSIVMCP重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了GSIV-MCP多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明,该多克隆抗体可与由GSIV感染引起细胞病变的EPC细胞(GICB)发生特异性的结合。研究为建立GSIV免疫诊断方法以及为研究GSIV MCP基因编码蛋白的功能奠定了前期基础。     

人癌症/睾丸相关蛋白XAGE-1b原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的构建人癌症/睾丸相关蛋白XAGE-1b原核表达载体及诱导XAGE-1融合蛋白表达。方法从文库质粒pACT2-XAGE-1b中利用PCR法扩增XAGE-b cDNA编码序列,将其克隆到pET-32a载体中,并将重组质粒pET-32bXAGE-1b转染大肠杆菌DE3中,用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,Western blot检测融合蛋白表达。结果原核表达载体pET-32a-XAGE-1b构建成功;转染菌株经IPTG诱导后,出现约29 kD蛋白过表达,Western-blot检测显示His6融合蛋白表达。结论成功构建原核表达载体pET-32a-XAGE-1b,转染菌株可表达His6融合蛋白。     

内含肽融合标签介导的人乙醛脱氢酶2基因原核表达

为获得高活性重组人乙醛脱氢酶2(ALDH2)重组蛋白,研究通过PCR获得ALDH2基因,先后构建克隆和表达载体p GEM-ALDH2和p TYB11-ALDH2。转化的阳性重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE显示融合蛋白获得大量表达。通过正交试验对表达条件优化设计,结果表明,诱导OD值0.3,30℃,IPTG浓度1.0 mmol·L-1,诱导表达4 h为最优表达条件。由于融合蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性,使用IMPACTTM-CN蛋白纯化系统,经内含肽标签蛋白自裂解洗脱、纯化,获得仅含有几个载体氨基酸的ALDH2蛋白,蛋白浓度为0.045 mg·m L-1。纯化的ALDH2蛋白比活力为462 U·mg-1。