红鳍东方 SREBP-1和 SREBP-2基因克隆及表达分析

为了研究红鳍东方 SREBP-1和 SREBP-2基因的功能及在脂肪代谢中的分子机制，从红鳍东方脂肪组织提取总 RNA，反转录获得 cDNA 模板，利用设计的引物 PCR 扩增获得 SREBP-1和 SREBP-2开放阅读框（ORF）， SREBP-1基因 ORF 区的 cDNA 序列长度为3330 bp，编码1109个氨基酸，SREBP-2基因 ORF 区的 cDNA 序列为3444 bp，编码1147个氨基酸。实时荧光定量 PCR 检测 SREBP-1基因在红鳍东方不同组织中的表达特征，结果表明， SREBP-1在脑组织中表达丰度最高，其次为眼、脂肪组织、肠、鳃、脾脏、心脏及肝脏，在肌肉中表达丰度最低。将SREBP-1连接到原核表达载体 pET32a 上，利用 IPTG 对重组质粒 pET32a-SREBP-1在大肠杆菌 Rosetta（DE3）进行诱导表达，SDS-PAGE 电泳显示在141 kDa 处有特异性的条带出现。     

红鳍东方鲀去乙酰化酶SIRT3基因的克隆及原核表达

从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肝脏组织中提取总RNA,通过RT–PCR扩增,获得SIRT3基因的编码阅读框(ORF),用原核表达载体p ET32a(+)构建p ET32a/SIRT3重组质粒,用异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)将重组质粒p ET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示,红鳍东方鲀SIRT3基因(tr SIRT3)ORF区大小为1 263 bp大小,编码420个氨基酸。经IPTG诱导表达后,获得1个带组氨酸(His)标签的融合蛋白,目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了相对分子质量约66 000的重组蛋白。