微小毛霉凝乳酶的分泌表达、产物纯化及鉴定

采用基因工程的方法对微小毛霉(Mucor pusillus)凝乳酶进行分子改造,获得适于乳品工业生产用的凝乳酶,克隆到了微小毛霉凝乳酶基因,构建了酵母表达质粒pPIC9K/M。线性化后电击转入毕赤酵母GS115,在甲醇诱导下进行凝乳酶的初步发酵试验,通过pH反应及酶抑制反应试验证明,重组凝乳酶获得了分泌表达。SDS-PAGE分析表明重组凝乳酶的分子量约为46 kD,与理论值(45.3 kD)基本相符,培养基上清液中凝乳酶的活性为311.8 U/mL,纯化的总回收率为51.89%,纯度达到92%。     

前导肽区域N-糖基化影响骆驼凝乳酶原在毕赤酵母中的分泌表达和热稳定性研究

骆驼凝乳酶原在毕赤酵母中的表达量较低,不能满足产业化需求。为提高骆驼凝乳酶原的表达量,采用定点突变的方法,分别在其前导肽的第11、26、34、35、38、39位氨基酸处引入1个N-糖基化位点,构建成6种骆驼凝乳酶原的N-糖基化突变体：chy11、chy26、chy34、chy35、chy38和chy39,并分别导入到毕赤酵母中进行分泌表达。测定和比较了野生型（wild）和各突变体骆驼凝乳酶原的表达量。Chy34、chy35、chy38和chy39的表达量显著提高,其中chy34的表达量最高。6种突变体均保持前导肽自切割活性。在50 ℃保温8 h,wild酶活完全丧失,而突变体仍有20%~80%的相对酶活,表明6种突变体的热稳定性均显著增强。研究结果为提高骆驼凝乳酶原在毕赤酵母中的表达量和增强热稳定性提供了新的研究思路。     

微孢根霉产凝乳酶的发酵条件优化

筛选得到一株高产凝乳酶的菌株F518,鉴定为微孢根霉。通过单因素试验优化了微孢根霉F518液体发酵产凝乳酶的发酵条件。结果表明:发酵产酶的最适碳源为酒糟,最适氮源为酵母浸粉,培养基最适初始pH为5.0。在优化后的发酵条件下30℃培养72h,微孢根霉F518产凝乳酶活性最高,达到1 001SU/mL。微孢根霉F518在凝乳酶生产方面有很大的应用前景。     

外源过氧化物酶在毕赤酵母中的优化表达

为提高外源过氧化物酶基因在毕赤酵母中的表达量,对甲醇毕赤酵母诱导表达培养基进行优化,在培养基中添加0.5 g/L高铁血红素,每12 h补加100%甲醇至终浓度为0.5%,待酵母生长量达到最大值时加入0.5 m L/L微量元素混合物。结果表明,优化后培养基表达量是普通培养基的10.6倍,研究为后期外源蛋白进入发酵罐生产提供了理论依据。     

利用酿酒酵母ZM1-5制备活性干酵母的工艺条件优化试验

【目的】以糖蜜为底物,建立将实验室的耐高温酿酒酵母ZM1-5制作成活性干酵母的工艺条件,将酿酒酵母ZM1-5制作成活性干酵母,大规模制备活性干酵母提供依据。【方法】对酿酒酵母ZM1-5在种子培养基中的培养时间、糖蜜培养基的配方、发酵液的离心条件、酵母的干燥条件以及酵母干燥保护剂进行了优化。【结果】酿酒酵母ZM1-5在种子培养基中培养时间18h,OD_(600)达到4.62。培养基中当糖蜜浓度为18°Bx时,酵母的生长状况最好,增殖最多;添加尿素对酵母生长有促进作用,添加量为1.5g/L时OD_(600)的值为14.39;添加KH2PO4对酵母生长有促进作用,添加量为2g/L时,OD_(600)为14.63。离心条件为6000r/min和10min时活菌率最高,此时活菌率达到了88.73%。干燥温度为40℃时的活菌率最高,达到了74.44%,45℃和50℃略有降低,分别是67.84%和65.95%,当干燥温度为55℃和60℃时明显降低,降到了50%以下。乳化剂对酵母干燥的保护作用较强,其中硬脂酸乳酸钠最好,当添加量为0.2%时,酵母干燥活菌率达到了84.16%。【结论】酿酒酵母ZM1-5在种子培养基中的培养时间为18h;糖蜜培养基的配方为:糖蜜浓度18°Bx、尿素1.5g/L、KH2PO42g/L;发酵培养基培养时间为24h;菌体离心条件为4℃、6000r/min离心10min,酵母收得率为88.73%;酵母细胞干燥条件为50℃干燥85min,在此条件下酵母细胞的存活率为66.95%;;最适添加剂为硬脂酸乳酸钠,添加量为0.2%,酵母细胞的活菌率为84.16%。     

灰盖鬼伞漆酶在毕赤酵母中表达及条件优化

根据灰盖鬼伞漆酶基因LCC1的蛋白序列和毕赤酵母的密码子偏爱性设计并合成CCLCC1I基因片段,将其连接到经过改造的pPIC9K质粒上构建分泌表达载体pYN2395;构建好的载体经BglⅡ酶切线性化后电激转化到毕赤酵母GS115中,通过ABTS底物显色反应筛选获得阳性转化子。从培养基、发酵温度、铜离子浓度和甲醇添加量等方面对重组酵母的发酵条件进行了研究。结果显示:添加0.6%的丙氨酸能极大地提高灰盖鬼伞漆酶的表达量,并确定最终优化组合为:培养基使用MMA,发酵温度为20℃,铜离子体积浓度为0.5mmol/L,甲醇添加量为1.0%/24 h。     

不同因素对羊奶干酪出品率和乳成分回收率的影响

以关中奶山羊奶为原料,探讨原料乳浓度、凝乳酶种类、杀菌条件、酸化条件和氯化钙添加量对羊奶干酪出品率和乳成分回收率的影响.结果表明,采用高浓度的原料乳,以羔羊皱胃酶为凝乳酶,经巴氏杀菌(63 ℃、30 min)后,酸化pH至6.4,并添加0.01%氯化钙时,羊奶干酪的出品率和乳成分回收率较高.     

红发夫酵母有机硒最佳转化条件的研究

[目的]优化红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)有机硒转化条件。[方法]通过正交试验研究硒添加量、培养时间和装液量对红发夫酵母富硒的影响。[结果]红发夫酵母富硒的最适培养基为PDA培养基,亚硒酸钠的添加方式为分2次添加,在硒添加量20 mg/L、培养时间30 h、装液量80 m L/500 m L的条件下,红发夫酵母的生物量达10.62 g/L,有机硒转化率达63.2%。[结论]研究结果为红发夫酵母富硒的进一步研究提供了参考。     

酵母表面展示IGRP_(206-214)-H-2K~d单链三聚体及对NOD鼠CD8~+T细胞的活化作用

通过酵母展示表达IGRP206-214-H-2Kd单链三聚体,筛选诱导条件获得高表达的IGRP206-214-H-2Kd单链三聚体酵母用于研究该三聚体诱导NOD鼠CD8+T细胞活化的作用。结果表明:转染IGRP206-214-H-2Kd单链三聚体的真核表达载体的酵母,在含2%D-半乳糖的酵母培养基中,20℃诱导18h,有77.1%的酵母能稳定表达IGRP206-214-H-2Kd单链三聚体蛋白。展示酵母与NOD鼠脾脏细胞共培养24hCD69+表达量最高,占CD8+T细胞的1.89%,共培养96h,CD25+表达量最高,占CD8+T细胞的4.25%,说明酵母展示获得的酵母能稳定表达IGRP206-214-H-2Kd单链三聚体蛋白对NOD鼠CD8+T细胞具有活化作用。     

人溶菌酶重组酵母工程菌的构建和活性干粉的制备

本试验旨在构建一种胞内表达人溶菌酶的新型酵母工程菌,并利用其高蛋白、富含溶菌酶的特点开发新型动物饲料添加剂,避免直接使用人溶菌酶制剂带来的高成本、活性不稳定等问题。将来自胎盘的人溶菌酶h LYZ基因克隆至表达载体p PICZA上,验证后的重组载体电转化至X-33毕赤酵母中,经标准培养基BMGY/BMMY培养、甲醇诱导表达后,检测蛋白表达活力和人溶菌酶活力。在此基础上,以麦芽汁-蚕蛹为培养基,通过单因素试验和正交试验来优化培养基成分和摇瓶发酵条件。结果表明,人溶菌酶基因在重组酵母工程菌中成功表达且酶活力为1 920 U。以麦芽汁和蚕蛹浸提物为碳氮源,测得蚕蛹浸提物占40%并且营养盐含量为170μg/ml时最适合菌体生长。正交试验测得R值的大小为:生长阶段p H值诱导阶段甲醇含量接种量,最佳摇瓶发酵条件是生长阶段p H值为6,诱导阶段甲醇添加量为1%,接种量为3%。经发酵培养的新型酵母工程菌利用真空冷冻干燥技术制成干粉,活菌数为1 ml 1×109个,溶菌酶活性为1 320 U。上述研究结果为新型饲料添加剂的开发和利用奠定了基础。     

微小毛霉凝乳酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的表达

以微小毛霉基因组为模板,PCR扩增得到凝乳酶结构基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,连接穿梭载体pPIC9K,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并测定其核苷酸序列。测序结果证实扩增得到的片段为凝乳酶基因,与GenBank报道的序列（No.X06219）存在6对碱基的区别。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,构建重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-m cp,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/m l、具有多拷贝基因的整合重组菌pPIC9K-m cp-03。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得该重组菌凝乳酶活力为5 660 U/m l,比微小毛霉发酵液提高50多倍,且发酵液电泳结果表明毕赤酵母自身分泌的蛋白很少,只能看到约38.5 ku的凝乳酶蛋白条带。     

不同水平的氨基酸对小香鸡免疫性能与抗氧化性能的影响

选取120只健康、体重相近、出栏前5周的商品小香鸡为试验动物,随机分为苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸4个处理,每周称重1次。屠宰时,每个重复选取具有代表性的公、母鸡各1只,进行翅下静脉采血,分别测定免疫指标、抗氧化性能指标。结果表明,3种水平的苏氨酸处理对小香鸡免疫、抗氧化性能之间的差异不显著;添加0.3%的异亮氨酸比添加0.1%的异亮氨酸能显著提高小香鸡抗氧化性能;添加0.2%的异亮氨酸比添加0.1%异亮氨酸能显著提高总蛋白含量;添加0.2%的缬氨酸较添加0.3%缬氨酸能显著提高GSH-PX活性;添加0.2%的缬氨酸与添加0.1%的缬氨酸相比,总蛋白含量显著提高;添加0.3%的缬氨酸与添加0.1%的缬氨酸、0.2%的缬氨酸相比,总蛋白含量差异不显著;添加0.2%的缬氨酸处理的球蛋白含量与添加0.1%的缬氨酸、0.3%的缬氨酸差异显著;苏氨酸处理组与亮氨酸处理组球蛋白含量差异极显著,异亮氨酸处理组与亮氨酸处理组球蛋白含量差异显著,但是缬氨酸处理组球蛋白含量与其他3组差异均不显著。     

大豆查尔酮异构酶基因的克隆及粟酒裂殖酵母表达载体的构建

利用RT-PCR克隆Ⅱ型大豆查尔酮异构酶基因(CHI1A),然后将目的片段与克隆载体pMD18-T质粒相连接,检测后将目的基因重组于粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的MCS序列之中,使用电击法将重组质粒转化进入粟酒裂殖酵母中,用PCR和双酶切的方法来检测试验结果,表明获得了CHI1A完整开放阅读框(670bp),与已报道序列(NO:AY595413)的同源性达到99%。PCR和酶切鉴定表明,CHI1A已导入到酵母表达载体中。查尔酮异构酶基因的克隆、粟酒裂殖酵母表达载体的构建,为该基因的应用提供了依据。有望利用基因工程技术将该基因重组于酵母基因组中并表达目的蛋白,以此来催化合成黄酮和异黄酮类化合物。     

四氢嘧啶对热变性凝乳酶复性作用的研究

[目的]加深对部分失活的凝乳酶复性作用的了解,为热稳定性研究中部分失活态凝乳酶的制备提供参考。[方法]研究了四氢嘧啶存在的条件下,复性时间、热处理时间和热处理温度等因素对凝乳酶复性作用的影响。[结果]随着复性时间的延长,凝乳酶的活力逐渐上升。凝乳酶的复性主要发生在前24 h,36 h后凝乳酶活力基本保持稳定,复性后凝乳酶相对酶活力最高可提升21.8百分点,能够测到凝乳酶活力(相对酶活力损失93.3%)的热处理时间,从6 min延长到12 min。在酶活力损失相近时,含四氢嘧啶的凝乳酶在较高温度下(68~70℃)保温较短时间(1~5 min),复性所致的相对酶活力提升显著高于在较低温度下(61~65℃)长时间保温(30~180 min)。[结论]酶的热失活处理的温度和时间对酶分子结构的影响效应并不相同,较长时间的热失活处理比短时高温对酶结构的破坏更彻底。     

来源于Thermomyces sp.的植酸酶基因在毕赤酵母中的组成型表达

[目的]研究植酸酶基因在毕赤酵母中的组成型表达。[方法]用PCR方法从嗜热真菌(Thermomyces sp.)中扩增到去除信号肽和内含子后约1.4 kb的phyT基因编码区片段,并对该片段进行克隆与序列测定。[结果]序列相似性分析表明,克隆的植酸酶基因无信号肽和内含子,与报道的嗜热真菌Thermomyces lanuginosus植酸酶基因相似性最高,DNA序列相似性为95%。从验证后的转化子筛选得到了表达嗜热真菌植酸酶的重组毕赤酵母菌株p-phy T,SDS-PAGE分析显示其分子量约为45 kD,重组毕赤酵母成功表达植酸酶。与野生型菌株相比,结果显示重组植酸酶酶活性提高了12.6%,最适温度65℃,75℃仍有64%以上酶活活性;最适pH值为5.5。[结论]嗜热真菌植酸酶基因用组成型质粒能在毕赤酵母中表达。     

工艺参数对竹重组材性能的影响

探讨了施胶量、含水率、密度、加热温度和加热时间等因素对竹重组材性能的影响.结果表明:(1)施胶量越高,产品的各项性能越好,采用10%施胶量生产的竹重组材的静曲强度(M0R)及弹性模量(MOE)超过混凝土模板用胶合板的最大指标值.(2)当竹束含水率从4%增加至24%时,产品的吸水厚度膨胀率(TS)逐渐降低,力学性能则先升...     

大肠杆菌乙酰-CoA羧化酶基因异源表达对变铅青链霉菌次级代谢的影响

克隆组装了大肠杆菌的乙酰-CoA羧化酶基因acc,以研究其异源表达对变铅青链霉菌中2种“沉默”抗生素放线紫红素和十一烷基灵菌红素合成的影响。大肠杆菌ACC由4个基因编码,通过PCR扩增4个基因,并通过重叠延伸PCR加上ermE启动子,构建得到4个重组基因;再将重组基因依次组装得到异源表达质粒pHLZ11,接合转移到变铅青链霉菌中进行异源表达。结果显示：含有异源表达质粒的变铅青链霉菌接合转移子能合成放线紫红素而十一烷基灵菌红素产量提高。表明大肠杆菌acc基因异源表达能够激活变铅青链霉菌沉默抗生素的合成,并提高已有抗生素产量。     

桑叶在畜牧业中的应用研究

[目的]研究将桑叶作为畜牧业的饲料的可行性。[方法]通过添加一定数量的桑叶饲喂羊、牛、猪,与不添加桑叶组在同等条件下饲育作增重增效比较。[结果]添加桑叶饲喂的羊、牛、猪,比对照分别增加了66.07%、68.82%、69.41%。[结论]在畜牧业中应用桑叶作饲料可以明显提高经济效益,既丰富了桑叶的利用渠道,又开辟了畜牧业的饲料来源。     

茸毛基因和Tm－2nv及其重组基因型对番茄病毒病抗性的研究

茸毛、Tm-2nv重组基因型对病毒病的抗性调查结果表明:重组基因型间的病毒病抗性存在极显着差异,茸毛基因能极显着地降低病毒危害,而Tm-2nv各基因型间的病情指数却无显着差异.1993年秋季大田生态条件下,番茄病毒病危害潜力达63.48%,其中CMV、TMV分别约占67.7%和32.3%.CMV和TMV危害程度的相对大小是制订Tm-2nv和茸毛基因综合利用方案的重要依据,当CMV占主导地位时,主要以茸毛基因利用为宜.     

水稻SGR酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。