毕赤酵母高密度发酵产β-甘露聚糖酶的工艺优化

以表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌为研究对象,采用摇瓶发酵确定碳源、接种量、温度、p H基础条件,通过30 L发酵罐高密度发酵,探究菌体浓度、甲醇浓度、甲醇补料方式、溶氧量等条件对目的蛋白产量的影响,并通过正交试验优化发酵工艺条件。结果表明,最佳产酶条件为接种量10%,初始葡萄糖质量浓度30 g/L,诱导温度28℃,p H 5.0,溶氧量10%~20%。在此发酵条件下,最终细胞干重135 g/L,目的蛋白表达量5.04 g/L,最高酶活力29 600 U/m L,较优化前提高24倍,已满足工业化要求。     

植酸酶基因工程酵母PP-NP~m-8培养条件的研究

对植酸酶基因工程菌PP-NPm-8的培养条件进行了研究,发现种龄、接种量、生长培养基初始pH值及生长时间、诱导培养基初始pH值、甲醇诱导浓度均对工程菌的产酶有很大影响,优化后的工程菌培养条件为:种龄16 h,接种量3%,麦芽汁生长培养基最适初始pH 4.5,生长培养时间18 h,麦芽汁诱导培养基最适初始pH值5.0,甲醇诱导终浓度4%。工程菌在此条件下诱导培养36 h后产酶量可达85067 U/mL,比未优化培养条件时提高了近一倍。     

重组毕赤酵母摇瓶发酵产木聚糖酶条件优化

[目的]在摇瓶发酵条件下,研究甲醇诱导毕赤酵母工程菌K3产木聚糖酶表达规律。[方法]以重组木聚糖酶酶活为评价指标,采用单因素试验和L9（34）正交试验考察摇瓶发酵条件下pH值、接种时间、诱导剂浓度、诱导时间对酶活的影响。[结果]各因素影响程度依次为：pH值〉接种时间〉诱导时间〉甲醇浓度,最优表达条件为：pH值5.3,接种时间19h,甲醇诱导浓度1.25%,诱导时间192h,在此条件下菌株产酶酶活可达589.16IU/ml。[结论]该研究为木聚糖酶的工业化生产和应用提供依据。     

重组锰超氧化物歧化酶工程菌摇瓶发酵条件的优化

通过单因素试验对重组锰超氧化物歧化酶（Recombinant Manganese Superoxide Dismutase,rMn—SOD）工程菌的摇瓶发酵的培养基（碳源、氮源、无机盐）和培养条件（接种量、乳糖浓度、时间、温度、摇床转速、pH值等）进行了初步优化．结果表明,工程菌发酵的优化培养基组分（质量分数）为：1．5％蛋白胨、1．5％酵母提取物、1．0％NaCl、0．4％KH2PO4、0．8％K2HPO4、1．5％（体积分数）甘油、0．2％NH,C1和5mmol／LMnCl2．乳糖诱导表达的优化条件为：以5％接种量培养5h后,加入质量分数为0．25％的乳糖进行诱导表达6h．当发酵温度为37℃、摇床转速为180r／min、培养基的初始pH值为7．0时,表达的rMn—SOD的酶活力高．在优化条件下,工程菌的SOD活性达1969．9U／mL,比活力达1081．8U／mg．     

环糊精酶基因在毕赤酵母中的组成型表达

为实现环糊精酶在毕赤酵母中的高效表达,以优化合成的环糊精酶基CGT2为基础,构建组成型表达质粒pGAPZαA-CGT2,运用电转化方法将目的基因整合进酵母染色体,构建环糊精酶酵母工程菌X33/pGAPZαA-CGT2,经摇瓶发酵120h后,CGT2活力达0.21 U·mL~(-1);进一步对工程菌进行摇瓶发酵条件优化,确定其最优发酵条件为:pH6.5、28℃、200r·min~(-1)、每24h补加2.5%的甘油,120h后其胞外酶活力达到0.36U·mL~(-1),是优化前的1.7倍,实现了环糊精酶在毕赤酵母中的组成型表达。     

麦芽根发酵生产碱性木聚糖酶

目的:Bacillus pumilus M-26以麦芽根为碳源发酵生产碱性木聚糖酶。方法:以单一麦芽根和复合麦芽根分别为碳源,首先确定碳源组成及浓度、氮源组成及浓度、无机盐种类及浓度,然后通过正交试验得出摇瓶发酵的培养基配方,最后进行20L发酵罐发酵生产碱性木聚糖酶工艺条件研究。结果:碳源:麦芽根,麦芽根:麸皮=7∶3,5%和8%,氮源:牛肉膏和氯化铵;无机盐:氯化钠、氯化钙及硫酸镁。摇瓶发酵条件,37℃,220 r·h-1,48 h,发酵罐发酵条件,37℃,24 h。单一碳源发酵培养基,麦芽根5%,Mg SO40.01%,氯化钠5 mmol·L-1,氯化钙1 mmol·L-1,氯化铵1.2%,牛肉膏1.2%,K2HPO40.4%,p H8.0;复合碳源发酵培养基,麦芽根麸皮7%,Mg SO40.03%,氯化钠1 mmol·L-1,氯化钙5 mmol·L-1,氯化铵1.0%,牛肉膏1.2%,K2HPO40.4%,p H8.0。摇瓶发酵最高产酶活力分别为268.38 IU·m L-1和363.13 IU·m L-1,发酵罐发酵最高产酶活力分别为748.58 IU·m L-1和1 348.99 IU·m L-1。结论:麦芽根与麸皮组成复合碳源经Bacillus pumilus M-26发酵生产碱性木聚糖酶,摇瓶产酶活力363.13 IU·m L-1,发酵罐产酶活力1 348.99 IU·m L-1。     

毕赤酵母工程菌表达人白细胞介素-2突变体发酵条件的优化

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）工程菌（KM71/pPIC9K-MvhIL-2,本室构建）能分泌表达三突变体人白细胞介素-2（MvhIL-2）,突变位点分别为125 Cys→Ala;18leu→Met;19leu→Ser.通过对其发酵条件的研究,探索重组人白细胞介素-2突变体工程菌KM71/pPIC9K-IL-2的生长及产物表达规律,通过3因素（即：发酵液起始pH值、甲醇诱导浓度、诱导时间）从3个不同水平上进行正交试验,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,得出摇瓶发酵表达MvhIL-2的最佳条件：发酵液初始pH 6.0,甲醇诱导浓度为0.5%,诱导72 h,最终使目的产物达到菌体总蛋白的30%以上,表达的MvhIL-2考马斯亮蓝染色条带最明显,为其进一步上发酵罐,大量生产重组人白细胞介素-2奠定了基础.     

毕赤酵母工程菌表达人白细胞介素-2突变体发酵条件的优化

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌(KM71/pPIC9K-MvhIL-2,本室构建)能分泌表达三突变体人白细胞介素-2(MvhIL-2),突变位点分别为125 Cys→Ala; 18leu→Met; 19leu→Ser.通过对其发酵条件的研究,探索重组人白细胞介素-2突变体工程菌KM71/pPIC9K-IL-2的生长及产物表达规律,通过3因素(即:发酵液起始pH值、甲醇诱导浓度、诱导时间)从3个不同水平上进行正交试验,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,得出摇瓶发酵表达MvhIL-2的最佳条件:发酵液初始pH 6.0,甲醇诱导浓度为0.5%,诱导72 h,最终使目的产物达到菌体总蛋白的30%以上,表达的MvhIL-2考马斯亮蓝染色条带最明显,为其进一步上发酵罐,大量生产重组人白细胞介素-2奠定了基础.     

产葡萄糖氧化酶工程菌培养基筛选及发酵条件优化

利用单因素试验和4因素3水平的正交试验L9(34)对1株产葡萄糖氧化酶毕赤酵母工程菌HL-69进行了研究,确定了该菌株的适宜廉价生长培养基和诱导培养基。生长培养基:葡萄糖1.5%、豆粕粉3.0%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.03%;诱导培养基:甲醇1.5%、氨水3.5%、磷酸二氢钾0.5%、硫酸镁0.03%。培养条件为:接种龄18h,接种量2%,培养基装液量为50mL/300mL,生长初始pH为5.0,诱导初始pH为6.0;在此条件下发酵,葡萄糖氧化酶酶活力达6.516U/mL,是发酵条件优化前酶活力的7.50倍。     

克氏原螯虾i-型溶菌酶在巴斯德毕赤酵母中的高效胞外表达及其抑菌活性（英文）

为开发虾类来源的溶菌酶,本研究建立了利用巴斯德毕赤酵母表达系统高效分泌表达重组克氏原螯虾无脊椎动物型溶菌酶1(简称"pc-iLys1")的方法。经密码子偏好性优化后的pc-iLys1 cDNA在毕赤酵母菌株SMD1168中成功地实现胞外分泌表达,重组蛋白分子质量约为17.1 kDa。在摇瓶中对诱导表达条件进行优化,获得的相对最佳表达条件为:培养基pH 7.0,培养温度28℃,甲醇体积分数1.5%,诱导表达时间96 h。采用该优化条件,进一步利用分批补料策略在5 L发酵罐中进行高密度培养诱导,120 h后获得重组pc-iLys1,其酶活性达到2 052.6 U/mL,最终,酵母干细胞质量浓度达98.1 g/L。抑菌实验表明,重组pc-iLys1对多种革兰氏阳性和阴性细菌均具有明显的抑制活性。总之,本研究实现了克氏原螯虾i-型溶菌酶在毕赤酵母中的重组表达,为其大规模制备打下了基础。     

昆虫病原细菌Cip蛋白基因工程菌发酵条件的优化

昆虫病原发光杆菌属(Photorhabdus)细菌产生的2种胞内晶体蛋白CipA和CipB已在大肠杆菌原核表达系统中进行稳定表达,为进一步提高该蛋白在大肠杆菌中的表达水平,确定工程菌摇瓶培养的最适条件,研究了多种无机离子、装液量、培养基初始pH值、诱导前添加葡萄糖等因素对工程菌摇瓶发酵的影响。结果显示,在发酵培养基中添加10 mmoL/L Mg2+和15 mmoL/LPO43-,调节初始pH值至7.2,装液量为25mL(250mL摇瓶),诱导前添加10g/L葡萄糖时,Cip蛋白的表达量可明显提高,发酵条件优化后CipA和CipB的表达量达到了39%和41%。     

重组凝乳酶摇瓶发酵条件的初步优化研究

凝乳酶是一种酸性蛋白酶,用作动物饲料添加剂,可提高动物特别是幼龄动物对饲料中蛋白成分的消化吸收率,促进其生长。本试验研究了由毕赤酵母胞外表达多拷微小毛霉凝乳酶的摇瓶发酵条件。确定最佳表达条件为：甲醇每24 h添加1.0%,无氨基酵母氮源培养基（YNB）添加1.5%,采用pH6.0的磷酸缓冲液,诱导120 h,在此条件下,重组凝乳酶的产量可达6 500 IU/ml。     

猪IL-18在毕赤酵母中分泌表达条件的优化

采用PCR方法从pGEM-IL-18重组质粒中亚克隆出IL-18基因并完成了真核融合表达载体pPIC9K-IL-18的构建和IL-18在毕赤酵母中的表达,在此基础上从发酵时间、不同诱导型、pH值、诱导剂量和接种量等方面对重组基因工程菌的摇瓶发酵条件进行了优化,进一步探索了酵母菌表达猪IL-18的发酵工艺.结果表明,摇瓶发酵时,诱导最佳时间为72 h,甲醇最适浓度为20 g/L,最适pH范围为6.0~8.0,最适接种量1∶1.与单纯甲醇诱导相比,甘油/甲醇诱导后的表达量明显提高.     

在毕赤酵母中表达人溶菌酶蛋白的研究

将化学合成的人溶菌酶基因htYZ（444bp）构建到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ上;载体质粒用SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母菌株GS115,在含Zeocin的抗性培养基筛选后PCR鉴定获得了9株重组菌株。重组菌株经甲醇诱导后取表达上清液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,重组hLYZ在毕赤酵母中成功表达,在诱导60h时表达量最高。用镍亲和层析柱纯化重组hLYZ,用Bradford法测得其含量约为324mg·L^-1。比浊法活性测定结果显示所表达的重组人溶菌酶活性达到4473U·mL^-1。本研究利用毕赤酵母分泌型表达载体成功表达了重组人溶菌酶,井探索了简单有效的纯化和活性测定方法,为利用毕赤酵母系统规模化生产重组人溶菌酶奠定了技术基础。     

米黑根毛霉脂肪酶的克隆表达及发酵条件优化

米黑根毛霉脂肪酶RML是一种重要的工业用酶,具有非常广泛的应用前景。本研究将人工合成的RML基因rml克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建pPIC9K-rml诱导型表达载体。表达载体经线性化后转化巴斯德毕赤酵母GS115,并使用抗生素G418筛选、三丁酸甘油酯-MM板及PCR方法筛选阳性重组工程菌。工程菌发酵液经SDS-PAGE分析、三丁酸甘油酯板鉴定,表明脂肪酶RML在毕赤酵母中获得高效表达,且蛋白分子大小与预期一致。进一步优化了发酵条件,包括对培养基组分、诱导剂浓度和发酵温度等的优化。优化后的培养基组成为：甘油4.0%,（NH4）2SO45.000 g/L,CaSO40.465 g/L,K2SO49.100 g/L,MgSO4.7H2O7.450 g/L;培养条件为：pH值6.0,生长阶段温度30℃,诱导阶段采用22℃低温诱导,诱导期每24 h补加甲醇浓度为3%。优化后,发酵液中的RML活力最高达到116 U/ml,比优化前提高了3.14倍。     

人C型溶菌酶发酵与分离纯化工艺的研究

[目的]研究毕赤酵母菌株(Pichia GS115)表达人C型溶菌酶(H-LYZ)的发酵与分离纯化的工艺.[方法]探讨酵母生长规律,研究不同菌体浓度、不同诱导时间对蛋白产量的影响,并且探讨不同pH条件对DEAE-SepharseFF和CM-Sepharose FF层析分离纯化目标蛋白的影响.[结果]毕赤酵母菌株表达H-LYZ的最佳发酵条件为:发酵24h用浓度1％甲醇诱导,以后每12 h用浓度1％甲醇诱导,共6次,在此条件下可获得高产量目标蛋白.DEAE-Sepharose FF和CM-Sepharose FF分离纯化目标蛋白的最佳pH分别为6.65和6.50.[结论]该研究可为人C型溶菌酶的工艺化生产提供理论指导.     

ChIFN-α酿酒酵母工程菌的发酵条件优化

在PCR检测重组菌株的遗传稳定性基础上,通过单因素试验和多因素正交试验,对酿酒酵母工程菌的实验室摇瓶发酵条件进行优化,得到重组工程菌株的最佳发酵条件为：发酵温度30℃,培养基pH值为5,15％的接种量,以3％的半乳糖作为诱导剂诱导,棉籽糖和葡萄糖作为碳源的发酵时间分别为24h和40h.     

整体优化的信号肽和人溶菌酶基因在毕赤酵母的高效表达

人源溶菌酶作为一种天然的抑菌活力物质,在畜牧、医药及食品等行业具有潜在的应用价值。本研究将信号肽序列和人源溶菌酶基因碱基序列作为一个整体进行密码子优化。并在优化的信号肽序列2处位置,共新插入39个碱基,构成增长的优化信号肽+溶菌酶优化基因。将2种优化的信号肽+溶菌酶基因碱基序列分别插入pPICZαA载体上,并整合到毕赤酵母KM71的基因组上,获得重组子K1(整体优化的α信号肽+人源溶菌酶基因)和K4(整体优化的α信号肽+人源溶菌酶基因又整合了增长信号肽)。摇瓶诱导表达72 h后,离心取上清液,通过Bradford法和比浊法测定发现,K4的蛋白质表达量和酶活力均高于K1。5 L发酵罐下,采用高密度诱导表达策略,诱导54 h后K4的总蛋白质表达量可达3.02 g/L,所表达的人源溶菌酶活力达到324 072.0 U/ml。表明整体优化的α信号肽+人源溶菌酶基因又整合了增长信号肽有利于提高溶菌酶的分泌效率,实现高效表达。     

人溶菌酶定点突变基因在毕赤酵母中的表达及活性分析

利用PCR法将人溶菌酶(h LYZ)成熟肽与载体信号肽连接处的氨基酸残基进行定点突变,突变基因亚克隆至酵母分泌型表达载体p PICZαA,重组载体线性化后通过电击转化法转化巴斯德毕赤酵母X-33,利用含Zeocine抗生素的YPDS平板筛选高拷贝转化子。转化子酵母经甲醇诱导后取培养基离心上清液进行SDS-PAGE和活性检测。结果显示,突变体h LYZ活力和表达量较野生型均有显著提高。表明定向改变h LYZ信号肽残基性质可以提高其表达量和分泌效率。     

蚕蛹蛋白高效分解菌的分离筛选及部分酶学性质的研究(英文)

[目的]获得蚕蛹蛋白高效分解菌,探索其有关酶学性质。[方法]从腐败蚕蛹中采用稀释平板分离蛋白高效分解菌。先进行菌株的初筛:取采集的样品2g,分别加入装有LB培养基的摇瓶中,置摇床上180r/min,37℃培养4～5d。将发酵液稀释一定倍数,涂布法进行分离,根据酪素培养基中单菌落透明圈和菌落直径比值(H/C)大小,选取H/C比值较大的菌株进行复筛。将初筛得到的待测菌株接种于发酵培养基中,32℃摇床培养60h。发酵液离心(4000r/min,5min)后取上清,测定酶活力,并比较不同菌株发酵液蛋白酶pH、温度作用范围。对筛选出的菌株所产中性蛋白酶再进行pH值条件下酶活力稳定性测验,酶活力热稳定性试验,及不同金属离子对中性蛋白酶活力的影响试验。蚕蛹粉采用筛选出的菌株固体发酵后,于60℃烘箱烘干,测定其中小分子蛋白含量。[结果]经筛选得到1株产中性蛋白酶的KB细菌,在摇瓶发酵条件下其酶活达到589.08U/ml,发酵蚕蛹粉后中小分子蛋白含量达到15.09%,比未发酵的对照和实验室现用菌株发酵分别提高了95.72%和15.67%,这表明KB菌株在蚕蛹粉发酵中优于实验室现用菌株。KB菌株所产中性蛋白酶在pH值6.5～9.0条件较稳定,pH值8.0为其最适pH值,在pH值8.0、温度55℃条件下处理0～30min时的酶活较稳定,残余酶活力在90.0%以上。[结论]初步获得蚕蛹蛋白高效分解菌。