法夫酵母整合型表达载体的构建

为了建立法夫酵母虾青素代谢途径研究和分子育种的技术体系,构建了法夫酵母的整合型表达载体.通过测定法夫酵母对G418的抗性来确定抗性筛选物的质量浓度,以来源于法夫酵母本身的rRNA基因为基因同源重组片段,利用法夫酵母肌动蛋白启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gpd）启动子,构建了携带G418抗性基因的整合型载体pMD-18spakta和pMD-18spgktg.结果表明：法夫酵母对20 μg/mL质量浓度的G418敏感,将构建的载体转化法夫酵母菌株后,筛选得到了能够在含有G418的培养基上生长的转化子;利用PCR的方法检测到转化子中存在的抗性基因.将筛选得到的阳性菌株连续传代培养10次后,发现该菌株的G418抗性仍然存在;以总DNA为模板,用PCR的方法仍可检测到G418抗性基因.说明已经构建得到了遗传稳定性良好的法夫酵母整合型表达载体,构建的质粒pMD-18spakta和pMD-18spgktg可作为法夫酵母整合载体应用于法夫酵母的DNA重组实验.     

一株耐热菌的产酶研究及其羧酸酯酶基因的克隆

将一株近海温泉耐热菌ZH1的16S rDNA克隆至pUCm-T载体进行测序,测序结果在NCB I上进行BLAST分析,并构建了系统发育树,将该菌株归属为Geobacillus sp.ZH1.在65℃条件下的产酶定性实验结果表明,该菌株产脂肪酶、木聚糖酶和碱性磷酸酶.以菌株ZH1的基因组DNA为模板,使用羧酸酯酶简并引物进行PCR扩增,将目的基因克隆至pUCm-T载体后进行测序,得到了741 bp的DNA片段.BLAST分析显示,目的基因预测编码羧酸酯酶,包含246个氨基酸.     

茶梗固态生料发酵产单宁酶研究

为促进茶梗的高效利用,对黑曲霉利用茶梗固态生料发酵生产单宁酶进行初步研究。结果表明：生料发酵产酶量是熟料发酵方式的3.2倍;茶梗中外加单宁酸对产酶没有明显影响,同时添加无机盐和碳氮源对产酶具有协同效应;蔗糖为产酶最佳碳源,但在产酶初期会对单宁酶的合成产生一定的抑制作用;氯化铵为产酶最佳氮源,在培养基中添加氯化铵既可提前单宁酶合成的时间,又可显著提高酶产量。添加质量分数为7%的蔗糖和氯化铵获得最高酶产量23.6 U·g^-1。试验结果为茶梗固态生料发酵产单宁酶奠定了一定的理论基础,并有助于促进对茶梗的规模化开发和利用。     

重组锰超氧化物歧化酶工程菌摇瓶发酵条件的优化

通过单因素试验对重组锰超氧化物歧化酶（Recombinant Manganese Superoxide Dismutase,rMn—SOD）工程菌的摇瓶发酵的培养基（碳源、氮源、无机盐）和培养条件（接种量、乳糖浓度、时间、温度、摇床转速、pH值等）进行了初步优化．结果表明,工程菌发酵的优化培养基组分（质量分数）为：1．5％蛋白胨、1．5％酵母提取物、1．0％NaCl、0．4％KH2PO4、0．8％K2HPO4、1．5％（体积分数）甘油、0．2％NH,C1和5mmol／LMnCl2．乳糖诱导表达的优化条件为：以5％接种量培养5h后,加入质量分数为0．25％的乳糖进行诱导表达6h．当发酵温度为37℃、摇床转速为180r／min、培养基的初始pH值为7．0时,表达的rMn—SOD的酶活力高．在优化条件下,工程菌的SOD活性达1969．9U／mL,比活力达1081．8U／mg．