嗜水气单胞菌对克氏原螯虾免疫相关因子活性的影响

将嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila )用灭菌生理盐水调节至1.5×104cfu/mL(I组)和1.5×103cfu/mL(Ⅱ组)的浓度后,注射法接种克氏原螯虾(Procambarus clarkii)(人工感染),定时检测供试克氏原螯虾的总血细胞数量(THCs)、淋巴液中酚氧化酶(PO)、超氧化物...     

嗜水气单胞菌在欧洲鳗鲡体内的免疫组织化学定位与病理观察

采用从鳗鲡分离的嗜水气单胞菌进行人工感染试验,以探讨感染后不同时期嗜水气单胞菌在欧洲鳗鲡肝脏、肾脏和肠道内的定位和由此引起的组织病理学变化.将细菌分2次对鳗鲡进行肌肉注射.第1次采用每克体质量103～107cfu的不同剂量注射以确定该菌的半数致死量,结果表明其半数致死量为5×104 cfu/g.第2次以每尾鱼1×107 cfu的剂量注射欧洲鳗鲡,此后分别在注射后6、24、48 h采集鳗鲡的肝脏、肾脏、肠道进行组织病理学和免疫组织化学定位研究.结果表明:3个时期的临床症状和病理变化存在一定的差别,鳗鲡早期无明显病理变化,而后期主要表现为败血症症状；鳗鲡肾脏组织的病理变化较其他脏器明显,主要表现为肾小管上皮细胞肿胀和肾小球坏死脱落；鳗鲡肝脏则主要表现为严重充血,肠道偶见肠粘膜脱落.免疫组织化学定位结果表明,感染细菌主要分布在鳗鲡肾脏内,肝脏和肠道也有感染细菌分布.     

一例中华鳖腮腺炎的诊断与防治

2021年5月，浙江诸暨某中华鳖养殖场中华鳖脖子肿胀、伸长，底板出现多处血点，并伴随大量死亡，经解剖可见腮部糜烂、充血明显，内脏呈现不同程度病变。从病鳖腮、肝、脾、肾、肠等组织分离纯化病原菌，经形态观察、生化鉴定确定其种属，并采用微量肉汤连续稀释法确定8种国标渔药对其最低抑菌浓度；同时，利用PCR方法检验是否存在病毒感染。结果显示：自有典型临床症状的中华鳖组织中分离到嗜水气单胞菌。药敏试验结果表明，该菌对恩诺沙星、硫酸新霉素和盐酸多西环素3种抗菌药物敏感。同时，在患病中华鳖内脏中检测到一种病毒，通过测序与构建系统进化树发现该病毒与中华鳖出血性综合征病毒同源性最高且聚为一支。病原回归感染试验结果表明，分离的嗜水气单胞菌与病毒均可引起中华鳖不同程度死亡。该例中华鳖腮腺炎为嗜水气单胞菌与出血性综合征病毒混合感染所致。该研究可为中华鳖腮腺炎的科学诊断与防控提供理论依据。     

嗜水气单胞菌外毒素免疫血清的制备及其对中华鳖红底板病的防治效果

将致病性嗜水气单胞菌扩大培养后提纯外毒素,用灭活外毒素免疫大白兔,制备免疫血清,再用兔免疫血清防治鳖红底板病。结果表明：对攻毒后１ｄ的中华鳖用免疫血清进行治疗,其成活率为３７．５％,对免疫后攻毒的中华鳖的保护率大于７５％。     

鳗弧菌单克隆抗体-胶体金检测方法的建立

以灭活鳗弧菌(SMW5)全菌为抗原,应用杂交瘤技术,制备了鳗弧菌单克隆抗体3株,分别命名为1H9、1C12、6F8,细胞亚类分别为IgG2a、IgM、IgG2b,其中1H9腹水效价为1∶6.4×105。制备鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体,效价为1∶3.2×105。应用纳米胶体金颗粒标记单克隆抗体1H9并制备金标垫,抗鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体与羊抗鼠抗体作为捕获抗体包被硝酸纤维素膜,分别作为检测线T和质控线C,建立鳗弧菌的胶体金免疫层析快速检测方法。经过对试纸条的特异性和灵敏度测定,结果表明:试纸条与嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、副溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌,7种水产常见病原菌没有交叉反应,与鳗弧菌特异性反应,检测灵敏度为6.3×104cfu·mL~(-1),检测所需时间低于10min。所制备的鳗弧菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高和适应基层生产推广应用等优点。     

嗜水气单胞菌外毒素免疫血清的制备及其对中华鳖红底板病的防治 …

将致病性嗜水气单胞菌扩大培养后提纯外毒素，用灭活外毒素免疫大白兔，制备免疫血清，再用兔免疫血清防治鳖红底板病。结果表明：对攻毒后１ｄ的中华鳖用免疫血清进行治疗，其成活率为３７．５％，对免疫后攻毒的中华鳖的保护率大于７５％。     

中华鳖暴发性传染病研究Ⅲ.嗜水气单胞菌感染症的血液生化和细胞病理

对患嗜水气单胞菌感染症的中华鳖的血液生化和细胞病理进行了检测.病鳖的内脏发生器质性病变,出血、充血,为败血症.病鳖血清的18项指标中有14项明显不同于健康鳖,其中谷草转氨酶(AST)、谷酰氨转肽酶(GGT)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(CREAT)、尿酸(UA)、尿素氮(UN)活性显著增加,而乳酸脱氢酶(LD)、淀粉酶(AMS)、碱性磷酸酶(ALP)、甘油三脂(TRIG)、胆固醇(CHOL)等活性大大降低.肝、肠等脏器细胞坏死,细胞核和细胞膜破裂,髓样结构增多或严重液泡化.用疫苗对中华鳖进行免疫可有效预防嗜水气单胞菌感染症.     

鳜致病性嗜水气单胞菌GYK1株的鉴定、毒力及溶血性

从患溃疡病的鳜肾脏中分离出一株病原细菌编号为GYK1。此株病菌人工感染鳜、银鲫、剑尾鱼,实验鱼出现出血、肌肉坏死或溃疡症状;腹腔注射攻毒,对鳜、银鲫、剑尾鱼、小鼠的半致死剂量(LD50)分别为8.33×104、1.06×105、1.26×105、1.05×106CFU/g;菌培养液上清能溶解鳜、加洲鲈、银鲫、小鼠、兔、绵羊、人O型血等的红细胞,在绵羊血平板上为β 溶血,不同代次和保存条件的细菌溶血性稳定。细菌在电镜下的形态、生化特性和ID32E系统自动鉴定的结果均符合嗜水气单胞菌的特征;PCR扩增检测到嗜水气单胞菌特异性的毒力基因气溶素基因(aerA)209bp片段,进一步说明此株病原细菌为含有毒力基因的嗜水气单胞菌。实验结果表明,GYK1是一株毒力和溶血性均较强的嗜水气单胞菌。     

鳜致病性嗜水气单胞菌GYK1株的鉴定、毒力及溶血性

从患溃疡病的鳜肾脏中分离出一株病原细菌编号为GYK1。此株病菌人工感染鳜、银鲫、剑尾鱼,实验鱼出现出血、肌肉坏死或溃疡症状;腹腔注射攻毒,对鳜、银鲫、剑尾鱼、小鼠的半致死剂量(LD50)分别为8.33×104、1.06×105、1.26×105、1.05×106CFU/g;菌培养液上清能溶解鳜、加洲鲈、银鲫、小鼠、兔、绵羊、人O型血等的红细胞,在绵羊血平板上为β 溶血,不同代次和保存条件的细菌溶血性稳定。细菌在电镜下的形态、生化特性和ID32E系统自动鉴定的结果均符合嗜水气单胞菌的特征;PCR扩增检测到嗜水气单胞菌特异性的毒力基因气溶素基因(aerA)209bp片段,进一步说明此株病原细菌为含有毒力基因的嗜水气单胞菌。实验结果表明,GYK1是一株毒力和溶血性均较强的嗜水气单胞菌。     

右旋糖酐铁和嗜水气单胞菌感染对泥鳅GSTs活力的影响

以泥鳅为试验材料,利用嗜水气单胞菌和右旋糖酐铁作为诱导刺激物,以不同浓度嗜水气单胞菌菌液和右旋糖酐铁对泥鳅进行腹腔注射,研究病原细菌和金属离子对泥鳅GSTs酶活性的影响。在分别注射病原微生物后0,2,6,10,16,24,40,50 h以及注射右旋糖酐铁后1,2,3,4,5 d取泥鳅肝胰组织,测定其谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)的活力,并研究其变化规律。结果表明：不同浓度的嗜水气单胞菌对泥鳅GSTs均有诱导作用,2.1×109 cfu·mL-1浓度组对泥鳅GSTs的诱导作用最大,2.1×107和2.1×105 cfu·mL-1浓度组则相对来说诱导作用较小。各处理组GSTs活力在处理后一段时间内达到峰值后逐渐降低到正常水平,实验组的GSTs活力均显著高于对照组。不同浓度的右旋糖酐铁对GSTs的作用不同,低剂量组(10 μg·g-1)对GSTs活性有显著性的诱导作用(P<0.05),且在第1天时诱导作用达到最大,随后逐渐降低到正常水平;中剂量组(25 μg·g-1)和高剂量组(50 μg·g-1)对GSTs活性有一定抑制作用,且在第4天时抑制作用达到最大,但随后逐渐增加而趋近于正常水平。     

家兔免疫伊氏锥虫弱毒疫苗后的T细胞,IgG和IgM动态变化

分别以3Ｈ—ＴｄＲ掺入的淋巴细胞转化反应和ＢＡ—ＥＬＩＳＡ方法检测家兔免疫后及攻虫后Ｔ细胞及特异性抗体ＩｇＧ和ＩｇＭ的动态变化。发现免疫后家兔外周血Ｔ淋巴细胞增殖反应于２４ｄ达到高峰,第３１天开始迅速降低。攻虫后特异性Ｔ细胞增殖反应强度未见升高,而特异性抗体Ｉｇｈ、ＩｇＭ均于第２１天达到高峰,攻虫后ＩｇＧ、ＩｇＭ分别在第６天和第９天又达到高峰。结果表明,在这种抗锥虫免疫中Ｔ细胞没有起主导作用,而特异性抗体ＩｇＧ和ＩｇＭ起主导作用。     

家兔UCP1 第3外显子基因多态性研究

为了解兔肉质性状特征,给兔的品种选种选育提供理论依据,选择UCP1基因设计1对引物扩增其第3外显子及第2内含子部分序列,采用DNA池PCR反应,直接测序法快速检测比利时兔、新西兰兔和加利福尼亚兔3个兔品种UCP基因多态性.结果在新西兰兔中发现1个多态性位点(T387C),多态位点对UCP1基因的RNA结构产生影响,其最小自由能由-917.51 kJ/mol变为-927.12 kJ/mol,而其他2个品种没有检测到该突变.     

不同旋毛虫隔离种对低温抵抗力的研究

分别用来自黑龙江省猪、犬体内的旋毛虫和国际标准虫种旋毛形线虫(Trichinella spiralis)和本地毛形线虫(Trichinella nativa)感染兔,在-20℃和-30℃条件下对其进行冷冻试验。结果表明,猪旋毛虫和T.spiralis对低温耐受性较差,兔肌肉内的猪旋毛虫幼虫在-20℃经7 d、在-30℃经1 d就失去感染性,T.spiralis的幼虫在-20℃经1 d、在-30℃经1 d已全部死亡;而犬旋毛虫和T.nativa对低温抵抗力较强,犬旋毛虫幼虫在-20℃经20 d、在-30℃经过23 d仍未失去活力,T.nativa的幼虫在-20℃经36 d、在-30℃经28 d才失去感染性。     

6个家兔群体KAP6.1基因的遗传多样性分析

设计了2对特异性引物,经过序列拼接,获得了家兔KAP6.1基因的全长CDS序列,并采用PCR-SSCP方法对6个家兔群体KAP6.1基因的全长CDS序列进行分析.结果显示,KAP6.1-1座位发现了2个等位基因,3种基因型,且A755G突变处于该基因的增强子区域,而KAP6.1-2座位未发现突变位点;6个家兔群体均处于哈代-温伯格平衡,表现为中度或低度多态;福建黑兔与九嶷山兔、有色獭兔与白色獭兔、皖系长毛兔与苏系长毛兔的不同基因型分布差异不显著(P0.05),而其他家兔群体彼此间的不同基因型分布存在显著(P0.05)或极显著差异(P0.01).     

转G10aroA棉花株系的获得及分子生物学鉴定

【目的】培育具有抗草甘膦除草剂的棉花材料具有极其重要的意义。利用农杆菌介导法在棉花中转入编码EPSPS酶的抗草甘膦除草剂基因G10aroA,通过体细胞愈伤诱导组织培养技术获得能够稳定遗传的转基因棉花株系材料。【方法】首先,利用不同草甘膦抗性筛选条件比较分析不同棉花受体材料的愈伤诱导效率;其次,以R15材料作为受体,利用含有G10aroA的农杆菌侵染下胚轴切段,在进行体细胞愈伤诱导的组织培养过程中通过草甘膦抗性筛选获得棉花再生植株,对获得的棉花再生植株进行纯合繁育。在此基础上,利用PCR扩增检测证实外源G10aroA在转基因植株中能够稳定遗传;利用RT-PCR分析其外源基因在转基因植株不同组织中的转录水平进行研究、并进一步利用Western-blot对转基因植株中外源蛋白的表达进行分析。【结果】在优化的草甘膦筛选条件下,以草甘膦浓度为2.5 mmol•L-1的抗性条件进行棉花愈伤诱导筛选并获得棉花再生植株;利用特异引物进行PCR检测结果表明,在检测的全部再生植株中,扩增得到1.8 kb预期大小目标条带的阳性株系32株,其中,收获的27个株系的外源目标基因能够在T0、T1转基因植株中稳定遗传;对G10aroA在转基因株系L12、L14的不同组织中的转录表达进行定量RT-PCR分析表明,外源G10aroA在转基因棉花植株的不同组织中表达具有差异,相对表达量高低依次为茎、苞叶、叶和花;另外,蛋白检测结果进一步表明,该外源基因能够在转基因株系L7、L12和L14中植株中正常表达为预期46 kD的EPSPS蛋白。【结论】通过农杆菌介导法转化外源抗草甘膦基因G10aroA,在草甘膦抗性条件下进行棉花体细胞诱导的组织培养,成功获得转外源G10aroA的棉花再生株系,并通过分子生物学方法研究证实外源G10aroA能够在T0、T1转基因株系中稳定遗传、转录以及表达。     

金田系列葡萄品种在浙江地区的引种表现

2009年由河北昌黎引入金田系列品种适栽,包括金田蜜、金田皇家无核、金田美指、金田0608、金田红、金田玫瑰、金田翡翠共7个品种,通过对引入品种物候期、生长结果习性、果实经济性状及抗病性的比较,筛选出综合性状较为优良的金田玫瑰和金田0608作为适合浙江地区种植的品种,并总结出配套的栽培技术要点.     

牛HSF1和HSBP1基因多态性分析

利用DNA测序技术对牛HSF1和HSBP1进行SNPs位点扫描,共发现4个新SNPs,包括HSF1 1451(G/T)位点、HSBP1第二内含子324(G/C)、589(C/T)和651(C/G) 位点。利用CRS-PCR和PCR-RFLP技术对867头荷斯坦牛、85头鲁西黄牛和28头渤海黑牛进行基因多态性分析。χ2检验表明,HSF1 1451(G/T)位点和HSBP1 589(C/T)位点在荷斯坦牛和鲁西黄牛群体中已达到Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05),而HSBP1 324(G/C)和651(C/G)位点的突变在荷斯坦牛群中均未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.05)。HSF1 1451位点(G/T)AA基因型频率最高,优势等位基因为A,而HSBP1 3个SNPs频率最高的基因型分别为AB、AA和BB, 589(C/T)位点的优势等位基因为A,而324(G/C)和651(C/G)位点均为B。HSBP1 651(C/G)位点不同基因型的分布在三个牛品种中存在差异,在荷斯坦牛中AA型频率最低,而在鲁西黄牛和渤海黑牛中AA型频率最高,推测该基因型与耐热性有关。该结果将为奶牛耐热分子育种提供理论参考。     

TYK2基因与家兔肠炎的易感性研究

[目的]研究TYK2基因在家兔肠炎发生中的遗传效应,探讨其是否可以作为家兔抗病育种的辅助选择标记。[方法]通过构建病例组-对照组肠炎兔群和低纤维诱导的肠炎兔群,PCR产物纯化后直接测序,以及qRT-PCR法检测TYK2基因在回肠和结肠组织中的mRNA表达水平。[结果]发现TYK2基因外显子区域有5个c SNP,只有c.1477(c.1477,CT)位点发生非同义突变,导致氨基酸p.Leu 404 Phe(LF)的改变,C等位基因增加了肠炎的易感性(OR:1.36;95%CI 1.269~2.151;P=0.019),而等位基因T对肠炎的发生起到了一定的保护作用(OR:0.81,95%CI 0.352~0.960;P=0.018)。TYK2基因不同基因型和不同肠炎程度的mRNA水平均呈现差异表达(P0.05)。[结论]TYK2(c.1477,CT)是家兔肠炎易感风险基因,为家兔的抗病育种提供了一个可靠的辅助选择标记。     

牛LAP3基因内含子12和外显子13单核苷酸多态性

采用单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism,SSCP)、创造酶切位点PCR(created restriction site-PCR, CRS-PCR)、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)以及直接测序方法,研究中国荷斯坦牛、鲁西黄牛和渤海黑牛LAP3基因第12内含子和第13外显子的单核苷酸多态性(SNP)。共检测到5个SNP,分别为24 794（T/G）、24 803(T/C)、24 846（T/C）、24 564（G/A）和25 415（T/C）,其中24 564（G/A）为首次报道的位点。经PCR-SSCP结合测序图谱发现24 794（T/G）、24 803(T/C)、24 846（T/C）位点完全连锁,但该连锁位点在鲁西黄牛群体中未检测到。5个SNP位点在中国荷斯坦牛、鲁西黄牛和渤海黑牛群体的优势等位基因相同,分别是T、T、T、G、T,其等位基因频率分别是T（CH 0.579/LY 1/BB 0.722）、T（CH 0.579/LY 1/BB 0.722）、T（CH 0.579/LY 1/BB 0.722）、G(CH 0.584/ LY 0.775/BB 0.500)和T(CH 0.596/LY 0.796/BB 0.750),多态信息含量均在0.25至0.5之间,属于中度多态。     

济宁青山羊MTNR1A基因外显子2的克隆与序列分析

对常年发情的山羊品种济宁青山羊和季节性发情的山羊品种辽宁绒山羊共20只母羊的褪黑激素受体1A(melatonin receptor 1A,MTNR1A)基因外显子2的824 bp扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析.结果表明,济宁青山羊MTNR1A基因外显子2的核苷酸序列与已发表的山羊序列(GenBank登录号AF419334)完全相同.济宁青山羊与辽宁绒山羊MTNR1A基因外显子2的差异由11个核苷酸变化(A52G、T232C、T253C、A256G、T358G、T410A、A414T、C424T、A554G、T559C和C589A)组成,核苷酸同源性为98.7%.济宁青山羊与绵羊、母牛、猪、人、小鼠、挪威大鼠、西伯利亚仓鼠、鸡之间MTNR1A基因外显子2的核苷酸序列同源性为73.5%～98.4%,氨基酸序列同源性为79.2%～98.5%.