快速检测生鲜肉中三种食源性致病菌

为同时快速检测生鲜肉中鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌和福氏志贺氏菌3种食源性致病菌,降低检测成本,制备了特异性单克隆抗体和多克隆抗体,研制出能够同时检测以上3种致病菌的胶体金免疫层析试纸条。结果表明,本试验成功筛选出3株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株2E3、2E7和2E8,3种单克隆抗体效价均在1.28×10~6以上,3种多克隆抗体效价均在2.00×10~6以上。制备的胶体金免疫层析试纸条对鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌和福氏志贺氏菌3种食源性致病菌的特异性良好,灵敏度均为1×10~4CFU/g。     

抗沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)单克隆抗体的制备及初步应用

制备抗沙眼衣原体(CT)单克隆抗体,建立沙眼衣原体的胶体金免疫层析快速检测方法。采用纯化沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)免疫Balb/c小鼠,选取高效价的免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,ELISA检测筛选分泌抗MOMP单克隆抗体(McAb)的细胞株并进行相关鉴定。共获得分泌IgG1,IgG2b和IgM的3株单克隆抗体杂交瘤细胞株。纯化的单克隆抗体与鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体、肺炎支原体均无交叉反应。通过位点分析选择配对良好的两株McAb,制备检测CT的双抗体夹心法免疫层析试纸条。制备的胶体金试纸条对MOMP的最低检出值可达50 ng·mL-1。     

猫泛白细胞减少症病毒单克隆抗体的制备及其制备胶体金检测试纸条的应用

制备猫泛白细胞减少症病毒(FPV)单克隆抗体,研制胶体金检测试纸条.用FPV临床分离株免疫Balb/c小鼠,取血凝抑制(HI)效价最高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,采用HI方法筛选获得2株可稳定分泌FPV单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对其用于胶体金检测试纸条进行评价.2株杂交瘤细胞3C3和4A1株,分泌的单克隆抗体重链亚型分别为IgG2b、IgG2a,轻链亚型均为kappa;腹水纯化后单克隆抗体3C3、4A1的HI效价分别为1:5120、1:10240.用胶体金标记单克隆抗体4A1,单克隆抗体3C3作为检测线,羊抗鼠二抗作为对照线制备的胶体金检测试纸条,检测FPV病毒液的灵敏度为103.7 TCID50/mL;检测猫源其他病毒如FHV-1、FCV均为阴性;批内和批间重复性检测不同含量的FPV结果一致;检测513份临床样品,与PCR的阳性符合率为76％(71/93),阴性符合率为100％(420/420),总符合率为96％(491/513).该研究制备的FPV单克隆抗体可用于FPV胶体金检测试纸条的生产,用于FPV的现场快速检测.     

副溶血性弧菌磁性试纸条层析体系的优化

为能够快速检测水产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus),本研究首先制备了副溶血性弧菌多克隆抗体,然后将其标记在磁珠上形成特异性磁纳米探针,再分别以副溶血性弧菌多克隆抗体和山羊抗兔Ig G作为检测线T线和质控线C线,建立了双抗夹心模式的磁性免疫层析试纸条。利用正交试验设计的方法,从Tween-20、BSA、蔗糖3种因素对层析体进行优化分析,结果表明这3个因素对层析检测的影响效果为Tween-20BSA蔗糖;当Tween-20含量为5%(V/V),BSA浓度为0.2 mg/m L,蔗糖浓度为0 mg/m L时,阳性信号最强,检测的准确性和灵敏度达到最优,通过单纯的肉眼观察,可在5~10 min实现1.6×104CFU/m L副溶血性弧菌的检测,通过T线所捕获磁信号的定量检测,可在30~40 min内实现4.1×103CFU/m L副溶血性弧菌的检测,为今后食源性致病菌的快速鉴定、诊断和检测提供了一种新途径。     

莴苣丛枝植原体胶体金免疫层析试纸条的初步研制

采用柠檬酸三钠还原法制备25 nm粒径胶体金颗粒,在pH 8.5的条件下与21μg/m L兔抗莴苣丛枝植原体(Le WB)免疫膜蛋白(Imp)多克隆抗体形成稳定的胶体金蛋白复合物,将兔抗莴苣丛枝植原体免疫膜蛋白IgG与羊抗兔IgG分别点在硝酸纤维素膜上作为检测线(T)和质控线(C),组装成胶体金免疫层析试纸条。结果表明:该试纸条除可以检测莴苣丛枝植原体外,还能检测与其具有相同免疫膜蛋白特性且隶属16SrⅡ-A亚组的其他植原体株系,如菊苣丛枝植原体(Ch WB)、扁豆花变绿植原体(Le VP)、蕹菜丛枝植原体(WSWB)、银胶菊花变绿植原体(Pa VP)等。试纸条可特异检测16SrⅡ-A亚组植原体株系,对莴苣丛枝植原体阳性材料的检测灵敏度为稀释100倍。     

罗非鱼无乳链球菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立

通过杂交瘤技术制备抗罗非鱼无乳链球菌SIP融合蛋白单克隆抗体2株:1C9和6G5,均为IgM,效价分别为10-5和10-4,间接ELISA结果显示单克隆抗体1C9对无乳链球菌具有良好的检测特异性和灵敏性;同时制备兔抗罗非鱼无乳链球菌SIP融合蛋白多克隆抗体及其HRP酶标记物,兔抗SIP蛋白多克隆抗体的效价为10-6,经标记的抗体效价为10-4,最佳抗体工作浓度为1:400.建立双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测罗非鱼无乳链球菌的方法,具良好的特异性,检测灵敏度为0.85×106 CFU· mL-1.双抗体夹心ELISA检测实际应用结果与双重PCR检测比较,相对符合率为98.33％,检测结果可靠性高.     

水产品中恩诺沙星残留胶体金免疫层析技术的研究

[目的]制备一种特异、快速、便捷的检测虾及鱼肉中恩诺沙星残留的胶体金免疫层析试纸条。[方法]用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金标记恩诺沙星多克隆抗体,喷于试纸的金标垫。将ENR-OVA(恩诺沙星和卵清白蛋白的偶联物)和纯化的羊抗兔IgG分别喷于试纸的T(检测线)处和C(质控线)处,通过挑选试纸条材料和调试工艺参数,并最终组装成试纸条。[结果]制备的试纸条检测体系方法的检出限为0.9 ng/ml。试纸条对虾及鱼肉中的恩诺沙星残留的检出限分别为5和10 ng/g。[结论]制备的恩诺沙星胶体金检测试纸适用于现场实际样品恩诺沙星残留水平检测,具有良好的应用前景。     

莴苣花叶病毒胶体金免疫层析试纸条的研制

为建立莴苣花叶病毒的现场快速检测方法,采用胶体金标记莴苣花叶病毒的兔多克隆抗体,在硝酸纤维素膜上喷涂检测T线和质控C线,制作胶体金免疫层析试纸条。该试纸条检测莴苣花叶病毒提纯病毒的灵敏度为1μg·mL-1,检测昆诺阿藜病汁液可稀释1 000倍(重量/体积)。试纸条可特异性检测到莴苣花叶病毒的3个分离物,与马铃薯X等8种病毒无交叉反应。田间采集的莴苣样品试纸条和酶联检测的结果一致。该试纸条适用于疑似莴苣花叶病毒感染的莴苣叶片的快速诊断,并在10min内获得检测结果。     

莱克多巴胺胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制

应用胶体金免疫层析技术建立了一种快速检测莱克多巴胺的方法.采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,标记莱克多巴胺单克隆抗体并喷于玻璃纤维上,莱克多巴胺偶联OVA抗原和羊抗鼠IgG分别结合于硝酸纤维膜上,依次将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装切割成莱兜多巴胺胶体金免疫层析快速检测试纸条.试验结果表明,陔快速检测试纸条的灵敏度为5 ng/mL,检测时间为5 min,批内和批问重复性为100%,假阳性率和假阴性宰均为0.     

抗H9N2 AIV HA单克隆抗体的制备及其在胶体金层析检测中的初步应用

用基因疫苗pcDNA-H9和纯化H9N2亚型AIV免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6),H9-02(3B1),H9-03(3H11),H9-04(1A4),H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01,H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。用制备的抗H9亚型AIV HA的单克隆抗体做成胶体金层析检测试纸条,可以检测到200个EID50的H9亚型AIV,为监测该亚型AIV试剂盒的进一步商品化奠定了基础。     

基于单克隆抗体的胶体金试纸条检测水产品中甲霜灵的残留

为了建立检测水产品中抗水霉药物甲霜灵残留的快速初筛方法,采用基于单克隆抗体技术的胶体金标记检测水产品中甲霜灵残留。甲霜灵单克隆抗体为IgG1,Kappa型;重链50 ku,轻链20 ku,分子质量约为150 ku;亲和力常数为2.46×10⁹ L/mol;IC₅₀为59.57 ng/mL。利用甲霜灵单克隆抗体作为金垫,甲霜灵-牛血清白蛋白偶联物及羊抗鼠IgG作为检测线与质控线,制备了甲霜灵胶体金免疫层析试纸条。测定结果显示:胶体金试纸条在甲霜灵质量浓度为5 mg/mL时可检出,与恩诺沙星、磺胺甲恶唑、氟苯尼考、呋喃唑酮、吡喹酮、强力霉素、孔雀石绿和亚甲基蓝等8种药物均无交叉反应。利用试纸条对草鱼(Ctenopharyngodon idella)、花蛤(Ruditapes philippinarum)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)等水产品样品进行测试,在草鱼、凡纳滨对虾样品最低检测限可达2 mg/kg,花蛤样品最低检测限可达1 mg/kg。利用高效液相色谱法验证试纸条检测甲霜灵残留,主要数据验证结果一致。基于单克隆抗体的胶体金免疫条快速、灵敏、特异性强,适合作为水产品组织中甲霜灵残留检测的初筛方法。     

鹿血双抗体夹心间接ELISA检测方法的建立

通过制备兔抗鹿血和小鼠抗鹿血多克隆抗体,建立了以兔抗为包被抗体,鼠抗为检测抗体的鹿血双抗体夹心间接ELISA检测方法。采用方阵滴定法确定了抗原、抗体的最佳反应浓度,并对ELISA各反应条件进行优化。结果表明:兔抗最佳包被浓度为1∶8 000,鼠抗的最佳反应浓度为1∶2 000,最佳封闭时间为60 min。该方法对鹿血检测灵敏,可达3×10-4倍稀释度,且对马血、牛血、羊血、猪血的检测结果均为阴性,说明该方法特异性良好。     

禽流感病毒感染与疫苗免疫鉴别诊断试纸条的研制及应用

 【目的】结合胶体金免疫层析技术建立一种适合养鸡业基层生产人员使用的便捷的快速诊断禽流感病毒感染鸡群的方法。【方法】将含禽流感病毒非结构基因ns1的表达载体KG-NS1转化入BL21（DE3）感受态细胞,筛选阳性克隆进行诱导表达,表达产物用GST亲和层析柱进行纯化和Western-blot分析;以NS1重组蛋白为诊断抗原,抗鸡IgFc的单抗标记的胶体金为示踪物,结合免疫层析技术,组装禽流感病毒NS1抗体的免疫胶体金鉴别诊断试纸条,评价其灵敏度和特异性,并对试验感染和临床采集的血样进行检测。【结果】NS1重组蛋白分子量约为52 kD,具有免疫学活性。在25 min内用肉眼观察到禽流感病毒感染鸡血清和NS1蛋白免疫鸡血清在试纸条的检测线处出现明显的棕红色,呈明显的阳性反应,而其它病原的血清在试纸条的检测线处不出现任何颜色,呈阴性反应。而且感染鸡群的NS1抗体在感染后3 d即可检测到,感染后1～2周为高峰期,维持时间约1周,检测阳性率为80%左右。临床样品的阳性率为9.1%。【结论】试纸条使用方便,操作简单,25 min内可以用肉眼判断结果,可区分禽流感疫苗免疫和野毒感染家禽,具有很大的推广应用价值。     

同时快速检测马铃薯X病毒、Y病毒和S病毒试纸条的研制

为实现在马铃薯种薯生产田现场同时快速检测马铃薯X病毒(PVX)、Y病毒(PVY)和S病毒(PVS),采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,利用抗体与胶体金相结合的特性制备金原子与PVX、PVY和PVS抗体结合物(简称金标抗体),通过三维划膜喷金仪将金标抗体喷射于玻璃纤维上作为金标垫,将PVX抗体、PVY抗体和PVS抗体分...     

鸭瘟病毒单抗的制备及胶体金试纸条检测方法的建立

【目的】鸭瘟（DP）是由鸭瘟病毒（DPV）引起的一种急性、败血性传染病,以头颈肿胀、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黄白色溃疡,头颈部皮下有黄白色胶冻样渗出为特征。该病一旦发生,发病急、死亡快、死亡率高,对养鸭业危害严重。快速诊断是控制鸭瘟的重要措施之一,可以及时确定病原,以便采取有效的防制手段。试验旨在建立鸭瘟病毒（DPV）胶体金快速检测方法。【方法】利用生物学软件Protean分析,选择鸭瘟病毒抗原表位较多的一段序列设计引物,PCR扩增目的基因。连接到载体pMD-18T上,测序正确后再连接到原核表达载体pET-28a上。将获得的重组质粒转化至Rosetta感受态细胞中进行诱导表达。表达的蛋白经纯化后测其浓度并经Western blotting鉴定分析。以表达的DPV-gB蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选及亚克隆,获得DPV-gB特异性单克隆抗体。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以制备的 H6F6单抗作为标记抗体（标记的最适pH为8.0-8.5,最佳标记浓度为15倍原液稀释）,将纯化的A8D7单抗（浓度为2倍原液稀释）和羊抗鼠IgG（浓度为10倍稀释）包被在硝酸纤维素膜（NC）上,分别作为检测线和质控线,经条件优化建立了鸭瘟病毒胶体金试纸条检测方法。【结果】共获得4株能稳定分泌抗DPV-gB蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。间接ELISA检测腹水效价分别为1:10³、1:10³、1:10⁵、1:10³。亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链。Western blotting结果显示4株单抗均能与DPV-gB蛋白特异性结合。IFA结果显示制备的4株单抗是针对DPV产生的。建立的胶体金试纸条方法能够特异性地检测鸭瘟病毒,与鸭坦布苏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、呼肠孤病毒、减蛋综合征病毒无反应。阳性尿囊液稀释50倍后用该试纸条检测依然为阳性;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异。利用制备的胶体金试纸条和PCR方法对38份临床样品进行检测比较,结果显示两者符合率为91.6 % 。【结论】本研究建立的试纸条检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,可用于DPV的快速检测。     

魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制

【目的】研制魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,为魏氏梭菌病的快速诊断提供新方法。【方法】采用分子生物学方法制备魏氏梭菌α毒素,将其免疫家兔制备多克隆抗体。用制备的抗魏氏梭菌α毒素多克隆抗体作为胶体金标记抗体和检测线上的捕获抗体,制备魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,对其特异性、敏感性、稳定性和重复性进行检测。用制备的魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条对临床样品进行检测,比较其检测结果与PCR检测结果的符合率。【结果】成功制备了魏氏梭菌α毒素多克隆抗体。成功研制了α毒素快速诊断金标试纸条,其检测线上抗体的最适包被质量浓度为0.06 μg/mL。研制的试纸条仅与魏氏梭菌α毒素发生反应,且不同批次的试纸条重复检测结果无差异,表明试纸条具有较高的特异性和重复性;该试纸条最低可检测1.40 mg/mL的毒素量,与PCR方法测得结果符合率为80.77%,基本能满足实际应用要求。【结论】成功研制了魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,该试纸条具有快速、特异、敏感、稳定等优点,适用于对魏氏梭菌病进行普查和检疫,具有良好的应用前景。     

一种新的抗多环芳烃多克隆抗体的制备（英文）

为实现环境中多环芳烃(PAHs)污染物的快速检测,制备了抗多环芳烃多克隆抗体,用于多环芳烃免疫学检测试剂盒的研制。采用活性酯法将半抗原芘丁酸(1-PBA)分别于牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联,获得PBA-BSA和PBA-OVA偶联物,以PBA-BSA偶联物免疫新西兰大白兔,获得针对多环芳烃的抗血清。以PBA-OVA偶联物为包被原,间接ELISA法检测抗血清,效价为102 400,经纯化后得到多克隆抗体。采用间接竞争ELISA法绘制了针对芘的标准曲线,得到该方法的IC50值为0.06 mg/L,检出限为0.01 mg/L。与16种多环芳烃的交叉反应实验结果表明该抗体对高环PAHs的亲和力较高。反应体系中添加低于40%的甲醇对ELISA结果无影响。该抗体的制备及特性鉴定对后续多环芳烃酶联免疫试剂盒的开发奠定了技术基础。     

牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的研制及初步评价

为了建立一种检测牛日本血吸虫病的快速诊断技术,试验以乳胶微球标记的兔抗牛IgG抗体作为免疫探针,以血吸虫可溶性抗原为检测线,羊抗兔IgG为质控线,研制了牛日本血吸虫病抗体检测试纸条。对该试纸条进行了效价、敏感性、特异性、非特异性、保存期、批内批间可重复性及符合率等各项试验,结果表明试纸条的效价为1∶2;对于实验感染日本血吸虫28 d和 35～56 d的病牛血清,试纸条的敏感性分别为20%（2/10—检出阳性份数/检测数）和100%（30/30）;用于检测健康牛血清的特异性为100%（20/20—检出阴性份数/检测数）,检测东毕吸虫、肝片吸虫、锥虫病牛血清,未见交叉反应现象;对于粪孵确诊为血吸虫病阴、阳性的牛血清,试纸条与粪孵法的阴阳性符合率均为100%;与IHA阴阳性符合率也均为100%;试纸条批内批间可重复性好,2～8℃保存的试纸条有效期达15个月。用试纸条检测实验感染血吸虫牛治疗前后体内不同时期血清抗体的水平,发现牛感染血吸虫后第5周的血清均可检测出血吸虫抗体,在治疗后第16～24周血吸虫抗体消失。