鸭瘟弱毒疫苗诱导IgA、IgM和IgG产生规律的研究

【目的】探讨鸭瘟弱毒苗诱导鸭局部黏膜和系统免疫中抗体发生的规律。【方法】将DPV弱毒苗Cha株经皮下、口服和滴鼻途径免疫20日龄樱桃谷鸭后60 d内定时随机剖杀5只鸭,采集血清、气管和消化道（食道、十二指肠、空肠和直肠）分泌液,应用间接ELISA检测抗DPV的IgA、IgM和IgG抗体滴度（以lg表示）。【结果】所有免疫鸭检测样品中均可检测到DPV特异性IgG、IgM和IgA抗体。血清中抗体滴度由高到低均为IgG、IgM和IgA,其中IgM检出时间最早,IgG存留时间最长。皮下免疫DPV弱毒苗可更早诱导鸭血清中生成特异性IgG,且抗体滴度最高;气管和消化道分泌液中抗体滴度由高到低均为IgA、IgM和IgG,其中IgA和IgM检出时间最早,IgA存留时间最长。口服和滴鼻途径免疫鸭消化道和气管分泌液中IgA滴度较皮下免疫鸭高。【结论】不同途径免疫鸭瘟弱毒疫苗均可迅速诱导免疫鸭体液免疫介导的黏膜免疫和系统免疫。以DPV特异性IgA为主要抗体的黏膜免疫在预防DPV强毒早期对鸭消化道和呼吸道等局部黏膜的感染中具有十分重要的作用,使DPV弱毒疫苗快速产生免疫保护的机制从黏膜免疫的角度得到一定程度解释。     

鸭瘟病毒gB蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备鸭瘟病毒(DPV)gB蛋白单克隆抗体,为建立DPV快速诊断方法及进一步鉴定DPV的抗原表位奠定基础。【方法】克隆DPVgB基因,构建其表达载体并进行原核表达,纯化DPV gB蛋白,以其作为抗原免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,进行间接ELISA及亚克隆筛选,并对单抗亚类及抗原性进行鉴定。【结果】PCR扩增出915bp的目的基因,成功连接于pET-28a载体,并转化大肠杆菌Rosetta进行诱导表达,获得4株稳定分泌抗DPV gB蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6,间接ELISA检测其腹水效价分别为1∶103、1∶103、1∶105、1∶103,亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链。Western blot结果显示4株单抗均能与DPV gB蛋白特异性结合,IFA结果表明4株单抗是针对DPV产生的。【结论】成功获得了特异性针对DPV gB蛋白的单克隆抗体。     

重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子

【背景】鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势。为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式（E451-dk,简称为Es）表达量最高。【目的】探讨不同启动子对Es 在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础。【方法】将pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过“Red E/T两步重组”克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情况进行测定。【结果】将重组突变体克隆转染细胞拯救获得了5株重组病毒rDEV-pro-Es。Western blotting分析表明外源蛋白Es在 pRSV调控下表达量最高,其表达量较rDEV-Es提高了169.12%。【结论】完成了Es在重组鸭瘟病毒载体中高效表达启动子的筛选,获得了一种调控Es高效表达的启动子pRSV。同时也获得了一株高效表达鸭坦布苏病毒外源基因Es的重组鸭瘟病毒rDEV-pRSV-Es。     

鸭瘟病毒PCR检测方法的建立

根据GenBank 发表的鸭瘟病毒(DPV)的基因序列,设计了针对DPV UL6 UL7保守区1对特异性引物。通过对反应条件的优化,建立了鸭瘟病毒快速鉴别诊断的PCR方法,扩增片段大小为1 293 bp。试验结果表明PCR法具有很强的特异性,且敏感性较高,最低DNA模板检出量为15 pg/mL。对鸭瘟的临床病料检测证明,该方法具有特异、快速和敏感的特点,可有效鉴别DPV。     

表达小鹅瘟病毒VP2蛋白重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性

【目的】鸭瘟和小鹅瘟是番鸭和鹅的两种重要传染病,鸭瘟最主要的防治措施是定期接种鸭瘟病毒减毒活疫苗。根据2012年国际病毒分类委员会（ICTV）的报告,DEV被归为疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科马立克氏病毒属。疱疹病毒如伪狂犬病毒、马立克氏病毒、火鸡疱疹病毒等已广泛用于病毒活载体的研究,而近几年也有关于鸭瘟病毒（DEV）作为疫苗活载体的报道。为了为免疫防控鸭瘟和小鹅瘟提供新手段,本研究拟在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上,构建表达小鹅瘟病毒（GPV）主要免疫原蛋白VP2的重组病毒rDEV-VP2,并研究其生物学特性,进而探讨重组病毒rDEV-VP2作为防治DEV和GPV的二联重组活载体疫苗的可能性。【方法】将密码子优化的GPV VP2基因通过常规基因克隆的方法插入转移载体pEP-BGH-end,构建含有GPV VP2表达框pCMV-VP2-BGH-pA的重组表达质粒。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,通过“Red E/T”两步重组法将GPV VP2基因表达框插入到DEV US7和US8基因之间构建了突变体克隆pDEV-VP2。利用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得重组病毒rDEV-VP2和删除Bac质粒序列的rDEV-VP2-Cre,并对重组病毒细胞体外生长曲线、蚀斑大小和VP2蛋白表达情况进行测定。将rDEV-VP2接种番鸭,在不同时间采集血清,采用间接ELISA法检测血清中GPV VP2抗体产生情况。【结果】间接免疫荧光检测和Western blotting分析表明,外源蛋白VP2在CEFs细胞成功表达。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果显示,rDEV-VP2在CEFs细胞上的增殖滴度与亲本株相比无显著差异,表明外源基因VP2的插入不影响rDEV重组病毒的增殖。动物试验结果表明,7日龄雏番鸭接种rDEV-VP2可以诱导产生针对GPV VP2的抗体,免疫后3周抗体阳性率为50%（4/8）。【结论】本实验将小鹅瘟病毒的主要免疫原基因VP2插入到DEV疫苗株基因组的US7和US8基因间构建了表达该免疫原性基因的重组鸭瘟病毒细菌人工染色体,继而在鸡胚成纤维细胞（CEFs）上拯救获得了重组病毒rDEV-VP2,病毒细胞生长特性与亲本株基本一致,且能诱导鸭体产生GPV VP2特异性的抗体。该研究为研制DEV-GPV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

冷鲜猪肉中单增李斯特菌快速检测试纸条的初步研制

【目的】建立一种可快速检测单增李斯特菌的胶体金试纸条的制备方法.【方法】用自制的单核增生性李斯特菌作为抗原对BALB/c小鼠进行免疫,之后通过杂交瘤技术进行细胞融合制备出特异性良好的单克隆抗体,并通过双抗夹心ELISA体系筛选出2株稳定且配对最佳的抗体,利用胶体金免疫层析技术组装试纸条并分析其特性.【结果】筛选出的2株单抗命名为3B7、5C9,测得其灵敏度均为104CFU/m L,抗体的最适p H值是8. 0,最佳抗体标记是24μg,试纸条的灵敏度为106CFU/m L且特异性良好.【结论】初步制备出可快速、准确检测冷鲜猪肉中单增李斯特菌的试纸条.     

纳米酶免疫层析试纸条法检测玉米褪绿斑驳病毒

【目的】建立纳米酶免疫层析试纸条(Nanozyme Immuno-chromatographic Strip Assay, NISA)检测玉米褪绿斑驳病毒方法。【方法】采用双抗夹心法,将纳米酶标记的鼠抗体IgG与McmV结合后,再与硝酸纤维素膜质控线上的鼠抗体结合,二氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB)滴加显色。【结果】采用研制的NISA和反转录PCR法(RT-PCR)对玉米褪绿斑驳病毒梯度稀释的研磨液进行检测,灵敏度分别为10^-7和10^-5;用其他4种病毒作对照进行特异性实验,无交叉反应;用该试纸条对供试样品进行检测,并以RT-PCR方法及基因测序方法对检测结果进行验证,三者检测结果一致。【结论】该试纸条检测McmV的灵敏度高、特异性强,可用于科研、农业生产单位和口岸机构对McmV的检测。     

鸭瘟病毒对SPF鸭的致病性研究

【目的】探讨鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）对SPF鸭的致病性。【方法】将DPV分别通过点眼滴鼻和皮下注射接种途径人工感染SPF鸭,以未攻毒健康SPF鸭为对照,观察各组鸭的发病情况及症状,于感染后不同时间随机剖杀试验组和对照组SPF鸭,采集肝脏、脾脏、肾脏、肺、心脏、气管、食道、肠道、胸腺、法氏囊、脑和泄殖腔等组织,常规方法制备石蜡切片,HE染色,观察各器官病理组织学变化,同时利用间接免疫荧光染色法（IFA）对DPV抗原在鸭体内的分布进行检测,并进行血常规和血液生化指标检测,分析了DPV对SPF鸭淋巴细胞转化率的影响。【结果】DPV接种后,引起鸭高热、下痢,组织器官出血、坏死,食道、泄殖腔黏膜出血、溃疡并有灰黄色假膜覆盖;病理组织学变化以血管壁损伤为主,肝、脾细胞变性、坏死,消化道黏膜上皮细胞坏死脱落。DPV感染后,在鸭的脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、食道、泄殖腔、肠道、肾脏、肺及气管中均检测到DPV抗原,且以肝脏、脾脏等组织中荧光最强;在脑和心脏中均未检测到DPV抗原。DPV感染组鸭血清中白细胞总数（WBC）、红细胞总数（RBC）、血小板总数（PLT）和总蛋白（TP）、血红蛋白（HGB）含量及丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性、淋巴细胞转化率与对照组差异大多达显著或极显著水平。【结论】DPV感染主要引起SPF鸭各组织器官广泛性出血;脾脏、胸腺、法氏囊等免疫器官首先受到攻击和损害,并造成免疫抑制;皮下注射接种DPV比点眼滴鼻接种对SPF鸭的致病性强。     

Pt-Pd合金纳米颗粒标记口蹄疫A型病毒抗体检测的免疫层析方法

【目的】为建立一种新型、高灵敏度,可直观与定量分析的快速检测方法,本研究创新使用具有氧化还原酶活性的合金纳米材料,将其作为标记物制备免疫层析试纸。待反应结束,使用TMB显色剂对免疫反应进行级联放大,可以显著提高检测的灵敏度,不仅可直观判断,也可精确定量分析,这为免疫层析技术标志物筛选与敏感性提高开拓了新的思路与方法。【方法】采用超声水浴法,通过抗坏血酸（AA）还原K₂Ptcl₄和Na₂Pdcl₄成功出制备Pt-Pd合金纳米颗粒,将其用于标记口蹄疫A型纯化抗原FMDV-146S,作为捕获抗原纳米标记物,再将纯化的A型表达抗原及其抗体（FMDV-146S-Ab）包被在硝酸纤维素膜（NC）上,分别作为检测线（T线）和质控线（C线）,经条件优化,建立口蹄疫A型病毒抗体Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条检测方法。对该免疫层析检测技术进行方法学考核,检测结果定量分析并建立标准曲线,同时与LPB-ELISA进行结果比对。【结果】该试纸条可在10 min内完成定性和定量检测,定量检测灵敏度为1:2⁸/test,线性范围 1:2⁶/test—1:2⁹/test;检测A型FMDV阳性血清,敏感性为98%,检测FMDV阴性血清、O型和Asia 1型的FMDV阳性血清以及其他动物常见病毒病阳性血清,特异性为94.8%;该试纸条重复检测效果良好;与OIE推荐LPB-ELISA法比较,相关性好,相关系数为0.9112。【结论】本研究开拓采用Pt-Pd合金纳米颗粒为标记物建立免疫层析方法,并首次应用于口蹄疫病毒抗体检测,结果证实其具备较高灵敏度,相比胶体金灵敏度可提高2⁴倍,同时具备可操作性与重现性。该研究是快速免疫层析技术的新尝试,为合金类纳米材料应用提供新的思路,未来具有实践应用前景。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制

【目的】研制魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,为魏氏梭菌病的快速诊断提供新方法。【方法】采用分子生物学方法制备魏氏梭菌α毒素,将其免疫家兔制备多克隆抗体。用制备的抗魏氏梭菌α毒素多克隆抗体作为胶体金标记抗体和检测线上的捕获抗体,制备魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,对其特异性、敏感性、稳定性和重复性进行检测。用制备的魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条对临床样品进行检测,比较其检测结果与PCR检测结果的符合率。【结果】成功制备了魏氏梭菌α毒素多克隆抗体。成功研制了α毒素快速诊断金标试纸条,其检测线上抗体的最适包被质量浓度为0.06 μg/mL。研制的试纸条仅与魏氏梭菌α毒素发生反应,且不同批次的试纸条重复检测结果无差异,表明试纸条具有较高的特异性和重复性;该试纸条最低可检测1.40 mg/mL的毒素量,与PCR方法测得结果符合率为80.77%,基本能满足实际应用要求。【结论】成功研制了魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,该试纸条具有快速、特异、敏感、稳定等优点,适用于对魏氏梭菌病进行普查和检疫,具有良好的应用前景。     

抗番鸭呼肠孤病毒(MDRV)单克隆抗体的制备及应用

【目的】制备抗番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的单克隆抗体,建立番鸭呼肠孤病毒病的间接免疫荧光（IFA）快速诊断方法。【方法】制备MDRV抗原,用之免疫Babl/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用IFA和ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备单克隆抗体,检测其生物学特性,应用制备的单克隆抗体建立MDRV IFA快速诊断方法。【结果】筛选到237-11,45-12和3-H3 3株特异性好并能稳定分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中45-12株单抗为IgM亚型,237-11和3-H3株单抗为IgG3亚型。45-12和3-H3 2株单抗具有ELISA特性,效价分别为10-4和10-5;237-11株单抗具有IFA特性,效价达10³。特异性测定结果显示,3株单抗仅与MDRV反应,而与正常细胞培养物（MDEF）、番鸭细小病毒（MPV）、鹅细小病毒(GPV)、禽呼肠孤病毒(ARV) 、鸭副黏病毒（PMV）和鸭肝炎病毒（DHV）均无交叉反应。应用抗MDRV单抗建立的IFA方法与病毒分离法（VI）的符合率为91%。【结论】筛选到2株具有ELISA特性、1株具有IFA特性且能分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,建立了MDRV IFA快速诊断方法,为番鸭呼肠孤病毒病的快速诊断奠定了基础。     

动物尿液中苯乙醇胺A胶体金快速检测方法的建立

【目的】苯乙醇胺A为一种新型违禁添加剂,目前的检测方法繁琐耗时,故建立动物尿液中苯乙醇胺A胶体金免疫层析快速检测方法。【方法】通过苯乙醇胺A与溴代戊醛发生亲核取代反应,制备得到苯乙醇胺A半抗原,将苯乙醇胺A半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原和包被原,经TNBS法测定半抗原与载体蛋白偶联比。用免疫原免疫BALB/c小鼠,制备特异性单克隆抗体,采用间接竞争ELISA方法测定单克隆抗体的灵敏度。选取与苯乙醇胺A结构类似的13种同类药物利用间接竞争ELISA方法进行单克隆抗体特异性的测定,计算交叉反应率。并通过胶体金、单克隆抗体-胶体金标记物、结合物释放垫、反应膜、样品吸收垫的制备以及试纸条的组装,建立了动物尿液中苯乙醇胺A胶体金快速检测方法,测定试纸条的检测限、假阳性率、假阴性率以及与ELISA方法的检测猪尿样品结果比较,验证试纸条的准确度,其中ELISA方法的标准品浓度分别为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg·L^-1,对猪尿样品的最低检测限为0.5 μg·L^-1,回收率为75%-105%。【结果】苯乙醇胺A半抗原制备结果显示从苯乙醇胺A的氨基端引入末端代醛基的连接臂,得到苯乙醇胺A衍生物,即苯乙醇胺A半抗原。TNBS法测定结果显示苯乙醇胺A-BSA和苯乙醇胺A-OVA成功偶联,苯乙醇胺A半抗原-BSA偶联比为11.38,苯乙醇胺A半抗原-OVA偶联比为10.66。间接ELISA检测结果显示MC-73杂交瘤细胞株的上清效价为1﹕2×10³,腹水效价为1﹕5×10⁷,较MC-33和MC-29的效价高,抗苯乙醇胺A单克隆抗体对苯乙醇胺A的IC₅₀为0.365 μg·L^-1,较MC-33和MC-29的IC₅₀低,得到MC-73单克隆抗体腹水灵敏度最高。苯乙醇胺A单克隆抗体与克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等共13种苯乙醇胺A的同类化合物的交叉反应率均小于1%,试纸条检测限为5 μg·L^-1,假阳性率为0,假阴性率为0。检测实际动物尿液样品时,试纸条与ELISA测定结果没有差异。【结论】成功研制出灵敏、特异、简便、快速的苯乙醇胺A胶体金免疫层析试纸条,可直接检测动物尿液,无需样品前处理,反应只需5 min即可得到检测结果。适合中国基层兽药检测实验室和企业大批量样品集中筛查及现场检测。     

同时检测牛奶中喹诺酮类和庆大霉素残留的胶体金免疫层析方法研究

【目的】喹诺酮类药物和庆大霉素均为高效、广谱抗菌药物,对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的抗菌效果,是中国畜牧业和水产业中常用的两类兽药。由于这两类药物在动物源性食品中的残留可能导致对人类健康的危害,因此,为了保护消费者的健康,研究和制定动物源性食品中同时检测这两类药物的残留检测方法对完善中国的食品安全监测体系具有重要意义。【方法】建立了同时检测牛奶中13种喹诺酮类和庆大霉素残留的胶体金免疫层析方法。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并对喹诺酮类和庆大霉素单克隆抗体按比例进行混合标记。同时,采用方阵法系统研究了胶体金标记这两类抗体时的pH值和抗体用量对灵敏度的影响,并对这两类药物抗原的包被条件进行选择确定。在此基础上研发出可同时检测牛奶中13种喹诺酮类药物和庆大霉素的胶体金快速检测试纸条,试纸条采用直接竞争法原理。【结果】该方法可同时检测恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氟甲喹、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、噁喹酸、麻保沙星、氟罗沙星、奥比沙星、达氟沙星和洛美沙星这13种喹诺酮类药物和庆大霉素,对其他喹诺酮类药物如：沙拉沙星、二氟沙星、司帕沙星、帕珠沙星等无交叉反应,同时对其他氨基糖苷类药物如：链霉素、新霉素、卡那霉素等也无交叉反应。该试纸条对牛奶中这13种喹诺酮类药物和庆大霉素的检测限均为20 ng·mL^-1,完全满足国家对这两类药物的残留限量要求。牛奶样本直接检测,无需处理,整个检测过程5 min内完成。【结论】采用该方法和HPLC-MS/MS对60份牛奶盲样进行比对试验,阳性样品全部检出,同时筛选方法未出现假阳性和假阴性现象,二者的测定结果基本相符,表明该方法准确可靠,适用于现场大批量样本的快速检测和筛选。实际操作过程中,可以采用胶体金免疫层析对样品进行现场快速初筛;筛选的疑似阳性样品,可以采用HPLC-MS/MS方法对样品中QNS和GEN的含量进一步确认。     

基于单克隆抗体的胶体金试纸条检测水产品中甲霜灵的残留

为了建立检测水产品中抗水霉药物甲霜灵残留的快速初筛方法,采用基于单克隆抗体技术的胶体金标记检测水产品中甲霜灵残留。甲霜灵单克隆抗体为IgG1,Kappa型;重链50 ku,轻链20 ku,分子质量约为150 ku;亲和力常数为2.46×10⁹ L/mol;IC₅₀为59.57 ng/mL。利用甲霜灵单克隆抗体作为金垫,甲霜灵-牛血清白蛋白偶联物及羊抗鼠IgG作为检测线与质控线,制备了甲霜灵胶体金免疫层析试纸条。测定结果显示:胶体金试纸条在甲霜灵质量浓度为5 mg/mL时可检出,与恩诺沙星、磺胺甲恶唑、氟苯尼考、呋喃唑酮、吡喹酮、强力霉素、孔雀石绿和亚甲基蓝等8种药物均无交叉反应。利用试纸条对草鱼(Ctenopharyngodon idella)、花蛤(Ruditapes philippinarum)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)等水产品样品进行测试,在草鱼、凡纳滨对虾样品最低检测限可达2 mg/kg,花蛤样品最低检测限可达1 mg/kg。利用高效液相色谱法验证试纸条检测甲霜灵残留,主要数据验证结果一致。基于单克隆抗体的胶体金免疫条快速、灵敏、特异性强,适合作为水产品组织中甲霜灵残留检测的初筛方法。     

禽流感病毒感染与疫苗免疫鉴别诊断试纸条的研制及应用

 【目的】结合胶体金免疫层析技术建立一种适合养鸡业基层生产人员使用的便捷的快速诊断禽流感病毒感染鸡群的方法。【方法】将含禽流感病毒非结构基因ns1的表达载体KG-NS1转化入BL21（DE3）感受态细胞,筛选阳性克隆进行诱导表达,表达产物用GST亲和层析柱进行纯化和Western-blot分析;以NS1重组蛋白为诊断抗原,抗鸡IgFc的单抗标记的胶体金为示踪物,结合免疫层析技术,组装禽流感病毒NS1抗体的免疫胶体金鉴别诊断试纸条,评价其灵敏度和特异性,并对试验感染和临床采集的血样进行检测。【结果】NS1重组蛋白分子量约为52 kD,具有免疫学活性。在25 min内用肉眼观察到禽流感病毒感染鸡血清和NS1蛋白免疫鸡血清在试纸条的检测线处出现明显的棕红色,呈明显的阳性反应,而其它病原的血清在试纸条的检测线处不出现任何颜色,呈阴性反应。而且感染鸡群的NS1抗体在感染后3 d即可检测到,感染后1～2周为高峰期,维持时间约1周,检测阳性率为80%左右。临床样品的阳性率为9.1%。【结论】试纸条使用方便,操作简单,25 min内可以用肉眼判断结果,可区分禽流感疫苗免疫和野毒感染家禽,具有很大的推广应用价值。     

赭曲霉毒素产生菌筛选方法的对比与优选

【目的】探求一种能够快速、准确地筛选出赭曲霉毒素产生菌的分析方法,为赭曲霉毒素的检测与防治奠定基础。【方法】分别采用紫外荧光法、胶体金免疫试纸条法和高效液相色谱 (HPLC) 法,对分离自葡萄表面的189株霉菌产生赭曲霉毒素A（OTA）的能力进行分析,并对3种方法的鉴定结果进行比较。其中在紫外荧光法中,黑曲霉接种至可可浆培养基（CCA）培养,其他霉菌接种至察氏培养基（CA）培养,培养后能够产生荧光的菌株被认为是OTA产生菌。同时分别用高效液相色谱法（HPLC）和OTA胶体金试纸条对所有菌株培养物中的OTA进行检测。【结果】以HPLC检测结果为标准,用紫外荧光法对OTA产生菌初筛的假阳性率较高,假阴性率为0;胶体金免疫试纸条法用于筛选OTA产生菌的假阴性率为47.4%,假阳性率为0,适合于产毒量高的菌种筛选。【结论】用紫外荧光法作为OTA产生菌的初筛方法可以排除大部分非OTA产生菌,漏检率低,从而大大降低HPLC检测的工作强度和检测成本;将紫外荧光法和HPLC定量分析结合使用,可以快速、准确地分离到OTA产生菌;将紫外荧光法和胶体金免疫试纸条相结合,可以快速筛选OTA产量高的菌株,且该方法较为经济,对环境和人体的污染较小。     

抗链霉素单克隆抗体的制备及其初步应用

【目的】筛选抗链霉素特异性单克隆抗体,并初步建立其竞争ELISA快速检测方法。【方法】用EDC方法将链霉素(SM)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备完全抗原SM-BSA及SM-OVA,SM-OVA免疫BALB/c小鼠,经细胞融合后,SM-BSA包被酶标板,ELISA筛选阳性克隆,并经有限稀释单克隆化及亚型鉴定,所获阳性克隆注射BALB/c小鼠,制备单抗腹水,并进一步western-blot鉴定其特异性,并对其竞争ELISA检测方法进行优化。【结果】经有限稀释,获单克隆抗体7株,其中链霉素特异性单克隆抗体1株,对其竞争ELISA反应条件进行了优化。【结论】获抗链霉素单克隆抗体1株,并初步建立了其竞争ELLISA方法。     

分泌抗春雷霉素单克隆杂交瘤细胞株的建立 及免疫学特性鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的抗春雷霉素单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】采用EDC法将KSM分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫原KSM-BSA和包被原KSM-OVA,经SDS-PAGE鉴定后,免疫Balb/c小鼠,免疫间隔4周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗KSM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗KSM的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】SDS-PAGE鉴定结果显示KSM-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的6只小鼠血清效价均达1:104以上,其中3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为73.9ng•mL-1,融合后筛选出两株杂交瘤细胞株1G7和2C8,亚型均为IgG1型,其细胞上清效价分别为1:5.12×103 和1:1.28×103,腹水效价分别为1:5.12×105和1:2.56×105,抗KSM的单克隆抗体对春雷霉素的IC50为8.902ng•mL-1,与其它竞争物的交叉率均小于0.03%。【结论】本试验成功合成了春雷霉素人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为春雷霉素免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。