内蒙古籽用西葫芦病毒病病原鉴定

【目的】对内蒙古自治区籽用西葫芦病毒病进行病原鉴定,并确定其分类地位,为该地区籽用西葫芦病毒病的防治提供理论依据。【方法】以采自内蒙古土默特左旗具有典型花叶症状的籽用西葫芦叶片为材料,对其进行sRNA深度测序和RT-PCR检测,并对所得序列进行一致性分析和构建系统发育进化树。【结果】对具有典型花叶症状的籽用西葫芦叶片的sRNA测序结果进行拼接,在数据库中比对共注释到14种病毒,其中西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus,WMV）、小西葫芦黄化花叶病毒（Zuchhini yellow mosaic virus,ZYMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV) 所占比例较高,分别为59.48%,20.70%和13.70%,这说明内蒙古自治区籽用西葫芦病毒病为多种病毒混合侵染引起。RT-PCR扩增除了检测到WMV、ZYMV和CMV外,还检测到马蹄莲潜隐病毒(Calla lily latent virus,CLLV)的外壳蛋白特异性条带。系统进化树分析显示,2个籽用西葫芦ZYMV分离物（MK002236和 MK002237）与伊朗蚜虫ZYMV分离物（KU528623）聚合在同一支;籽用西葫芦Z1 样品WMV分离物（MK015646）与意大利柑橘WMV分离物（FJ823122）亲缘关系最近,而Z2样品WMV分离物（MK015645）则与法国甜瓜WMV分离物、法国未知作物WMV分离物、法国西葫芦WMV分离物以及Z1 样品WMV分离物（MK015646）和意大利柑橘WMV分离物形成一个大分支。【结论】内蒙古籽用西葫芦病毒病主要病原为WMV、ZYMV和CMV,自然条件下常发生复合侵染。籽用西葫芦上最初的WMV和ZYMV可能由媒介昆虫或人从其他作物上传播而来,也可能是通过籽用西葫芦种子进口、国内调运而传播到本地的。     

沈阳市番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定

在辽宁省沈阳市辽中设施蔬菜产区采集到疑似感染番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)和番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)的番茄样品,利用ToCV的特异性引物ToC5/ToC6进行RT-PCR检测,结果从4份病样中检测到ToCV预期大小的特异片段。利用ToCV外壳蛋白(coat protein, CP)和热激蛋白(heat shock protein 70, HSP70)基因的特异性引物进行CP基因和HSP70基因扩增及序列测定,结果得到ToCV辽中分离物CP基因和HSP70基因全长分别为774bp(GenBank登录号:MF278016)和1665bp(GenBank登录号:MF278017),序列分析结果表明ToCV辽中分离物的CP核苷酸序列与北京ToCV分离物(KC887999)和河北的ToCV分离物(KP217196)的CP核苷酸序列的相似性最高,均为99.87%;HSP70核苷酸序列与山东ToCV分离物(KC709510)的HSP70核苷酸序列的相似性最高,为99.76%。同时该样品利用背靠背引物TY-F/TY-R对TYLCV的DNA-A分子进行全基因序列扩增及序列测定,结果得到TYLCV辽中分离物的DNA-A分子全基因长度为2784 bp,序列分析结果表明TYLCV辽中分离物与山东TYLCV分离物(GU199587)的DNA-A分子全基因核苷酸序列的相似性为99.64%。从而证实了沈阳市辽中区的番茄受到ToCV与TYLCV复合侵染。     

菜豆普通花叶病毒辽宁分离物的鉴定与序列分析

2016年8月,于辽宁省盖州市采集到表现为黄化的菜豆样品。利用Potyvirus通用引物Legpoty-F/Legpoty-R对3个代表样品进行RT-PCR扩增,得到预期725 bp的片段。Blast显示它们与菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus,BCMV)同源性最高。利用报道的特异引物BCMV-CP-F/BCMV-CP-R扩增到约1.2 kb的片段,包含完整的外壳蛋白(coat protein,cp)。基于cp基因进行同源性分析,发现它们与美国菜豆分离物BCMV-[USA:Iowa:Phaseolus vulgaris:11](KM023744)同源性最高,为97.9%。根据Potyvirus的分类标准,认为它们是BCMV的辽宁分离物。这是辽宁首次报道菜豆感染BCMY。     

小西葫芦黄花叶病毒辽宁分离物的鉴定与序列分析

从辽宁省沈阳市和盖州市分别采集表现花叶的南瓜样品,经透射电镜负染色实验,观察到典型的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)线状病毒粒子.利用Potyvirus通用引物Legpoty F/LegpotyR分别对3个沈阳样品和3个盖州样品进行RT-PCR扩增,得到预期片段,克隆并测序.Blast显示6个病毒样本与小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)同源性最高,均大于99%.利用已经报道的特异引物ZYMV-F/ZYMV-R,从6个样本中扩增到约1.2 kb的ZYMV片段,片段包含完整的外壳蛋白(CP)基因.基于CP的核苷酸序列同源性分析,发现2个ZYMV辽宁分离物与山西分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14](KP742962)同源性最高,达99.1%和99.4%.系统进化树分析表明,2个ZYMV辽宁分离物与山西分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14]聚集在一个分支,推测ZYMV辽宁分离物与山西分离物亲缘关系最近.     

侵染西瓜的西瓜花叶病毒生物学鉴定

用生物学、血清学及电镜等技术鉴定了侵染西瓜花叶病毒宿州分离物的基本属性。研究结果证明 ,该分离物侵染西瓜、南瓜等葫芦科植物并表现花叶 ;在苋色藜、千日红表现局部褪绿斑 ;桃蚜可传毒 ,该分离物汁液的致死温度为 5 5～ 5 8℃ ,稀释限点为10 - 3～ 10 - 4,体外保毒期为 6～ 10d。病毒粒体为线状 ( 73 0nm× 16nm)。该分离物的提纯物紫外光最高吸收峰在 2 60nm处 ,最小在2 40nm处。A2 6 0 /A2 80 =1.3 2。其病毒的RNA含量约为 8%。ELISA测定该分离物与西瓜花叶病毒 2号 (WMV -2 )的抗血清学反应为阳性。初步确定该分离物隶属WMV -2的一个株系。     

侵染西番莲的夜来香花叶病毒的分子鉴定及特异性检测

【目的】鉴定福建果园西番莲上的夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,Te MV),并建立用于该病毒特异性检测的分子快速检测方法,为该病毒的防治提供参考依据。【方法】采用血清学检测、电镜观察、通用简并引物RT-PCR、特异性引物RT-PCR对福建西番莲样品进行病毒检测,并对阳性样品的PCR产物进行克隆、测序;根据已报道的夜来香花叶病毒基因序列和本研究的序列测定结果,设计一对用于扩增Te MV外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长的特异性引物,通过反应条件优化,建立该病毒的特异性RT-PCR检测方法;序列测定结果利用BLAST程序和DNAMAN软件进行比对,同时对获得的CP基因序列采用Mr Bayes软件的贝叶斯法(Bayesian inference,BI)构建系统发育树并进行系统发育分析。【结果】血清学检测发现,一株表现有花叶、皱缩症状的西番莲样品与马铃薯Y病毒属(Potyvirus)通用抗体反应呈阳性;电镜观察结果表明,该株疑似带毒样品中含有大小约750 nm×12 nm的弯曲线状病毒粒子;Potyvirus通用简并引物RT-PCR从该样品中扩增到一条与预期大小相符的目的片段,克隆、测序获得长度为680 bp的序列,该序列与已报道的Te MV核苷酸序列一致性最高(98.2%)。特异性引物扩增获得的CP基因序列全长为816 bp(命名为BXGFJ-13分离物),与已报道的Te MV核苷酸序列、氨基酸序列一致性分别为86.2%—98.4%和88.2%—97.8%。系统发育分析结果表明,13个Te MV分离物共形成3个类群,相同地区或寄主来源的分离物优先相聚成簇,表现出很强的地理和寄主特异性。本研究获得的BXGFJ-13分离物与中国广西分离物(KJ789129)先以较高的后验概率聚为一个分支,再与泰国2个分离物(AM409188、AM409187)聚为第2类群(Group II),表明其在系统发育关系上与中国广西分离物的亲缘关系最近。利用特异性引物Te MV-CPf/Te MV-CPr建立的RT-PCR方法,具有良好的特异性,仅能从感染Te MV的西番莲样品上扩增出目的片段,而从黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、甜菜花叶病毒(Beet mosaic virus,Bt MV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)、虎眼万年青花叶病毒(Ornithogalum mosaic virus,Or MV)、洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)、东亚西番莲病毒(East Asian Passiflora virus,EAPV)等其他病毒样品及阴性对照上均未扩增出目的片段。灵敏度测定结果显示,该方法能从稀释102倍的RNA上扩增出目的片段。【结论】根据国际病毒分类委员会(ICTV)关于Potyvirus病毒不同成员的分类标准,同时结合血清学检测、电镜观察结果,证实福建果园表现花叶、皱缩症状的西番莲上携带有Te MV;建立的特异性RT-PCR方法能够用于Te MV的快速检测。     

侵染丝瓜的黄瓜绿斑驳花叶病毒山东分离物分子鉴定

2013年,在山东泰安采集到疑似感染黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的丝瓜样品,利用该病毒外壳蛋白(Coat protein,CP)特异引物CG-CPF/CPR对样品进行扩增并测序。所得序列(GenBank登录号:KJ187042)经NCBI BLAST比对,与已登录的CGMMV序列的相似性均大于92.6%,确定为黄瓜绿斑驳花叶病毒。系统进化分析表明,CGMMV山东丝瓜分离物(CGMMV-SDLoofah)与辽宁分离物(CGMMV-LN)等大多数国内CGMMV分离物同聚为一个进化组,从而进一步确定了CGMMV山东丝瓜病毒分离物为黄瓜绿斑驳花叶病毒。这是首次报道黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染丝瓜。     

一种鸡腿菇病害病原菌的分离及鉴定

从莒县鸡腿菇种植区采集到表现鸡爪症状的样品,分离得到病原菌分离物RZ,采用改良的CTAB法提取其基因组总DNA,利用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增其rDNA ITS区域序列,扩增产物纯化克隆后转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆进行测序。将获得的序列进行同源性比对和构建系统进化树,发现RZ分离物与GenBank中Bionectria ochroleuca 2个分离物聚为一簇,ITS的核苷酸一致率均为99.17%,从分子水平上证明该分离物为淡色生赤壳菌(B.ochroleuca)。     

江苏省葫芦科作物西瓜花叶病毒的分子鉴定和序列分析

[目的]对江苏各地具典型褪绿花叶症状的多种葫芦科作物是否为西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus,WMV）侵染进行分子鉴定,明确该病毒在江苏的遗传分化.[方法]提取样品总RNA,利用西瓜花叶病毒的cp基因特异性引物进行RT-PCR扩增,克隆测序,应用DNASTAR和Clustal X软件进行序列分析.[结果]来自南瓜、瓠瓜、西瓜和西葫芦的11个分离物的RNA模板中均检测到1200 bp左右的片段;序列测定表明该片段含1154个核苷酸,包含完整的编码281个氨基酸的WMV-cp基因.序列比对结果表明,11个分离物和来自不同地区的17个分离物WMV-cp基因核苷酸和推导的编码CP蛋白氨基酸序列同源性分别为90.5％～100.0％和92.9％～100.0％.[结论]WMV的遗传变异与地缘相关性较强而与寄主相关性较弱.江苏分离物WMV-CP氨基酸均具有蚜传株系的特征结构域DAG,暗示其田间流行与蚜虫有关.     

两步PCR法检测鸡新城疫疫苗中鸡毒支原体污染的研究

本试验以Genbank中登录的鸡毒支原体的16s rRNA基因序列为标准,根据前人设计的两套引物(外引物和内引物)对鸡毒支原体DNA进行两次PCR扩增,建立两次PCR扩增体系和条件。最后,用此体系和条件对从市场上随机购买的17支鸡新城疫La Sota系活疫苗样品和13支鸡新城疫Ⅰ系活疫苗样品进行检测。结果显示,运用建立的两次PCR扩增体系和条件可以从疫苗样品中检测到支原体的污染,外引物的检出率为23.3%(7/30),内引物的检出率为10%(3/30)。     

福州番茄黄化曲叶病毒的全基因组结构特征

为明确引起福建省福州市长乐地区番茄上曲叶症状的病原,提取样品总DNA,利用简并引物PA/PB进行PCR扩增,从10个样品中均可扩增到500 bp左右的特异条带.NCBI BLAST序列比对表明,该序列与番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)核苷酸序列相似性最高,达99.0%.再根据已知500 bp序列设计1对反向引物,扩增TYLCV分离物Fz01全基因组近全长,克隆并测序.经序列拼接发现,TYLCV分离物Fz01基因组全长2781 nts(KP685598),与已报道的TYLCV其他各分离物相似性均在89.3%以上,而与来自中国不同地区的TYLCV分离物的相似性均在98.7%以上.因此,Fz01属于TYLCV的一个分离物.     

葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ基因的克隆及序列分析

根据葡萄卷叶伴随病毒 美国分离物的 GLRa V- 3CP基因序列 ,设计并合成了 1对该病毒的 PCR引物 ,利用 IC- RT- PCR成功地检查到合适大小的 PCR产物 ;同时将PCR产物克隆到中间载体 PGEM- 3Zf上 ,转化大肠杆菌 DH5α菌株 ,筛选阳性克隆。通过双酶切以及序列分析表明 ,扩增样品与美国分离物的同源性为 94.1 %。     

利用RT-PCR检测黄瓜上的西瓜花叶病毒

根据西瓜花叶病毒2号(WMV-2)的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,含WMV-2外壳蛋白基因的质粒DNA为阳性对照,进行cDNA合成和PCR扩增。结果从感病组织中扩增出与预期的382 bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物。对2002和2003年采集的98份黄瓜病毒病样本进行了同样的RT-PCR检测,结果表明98份材料中77．55％检测到WMV-2。     

云南马铃薯A病毒分布及其外壳蛋白分子变异分析

为研究云南马铃薯A病毒(PVA)分布及其外壳蛋白的分子变异,2007年至2011年分别从云南滇西北、滇东北、滇中及滇南马铃薯种植区采集381份马铃薯样品,进行马铃薯A病毒DAS-ELISA检测,结果表明,PVA阳性样品共43份,其中滇西北22份,滇中17份,滇东北4份,滇南未检出。对带有PVA的部分样品进行电镜负染色观察,电镜下观察到长约750 nm、直径约15 nm的线状粒子。根据已报道的PVA外壳蛋白基因(cp基因)序列设计合成特异性引物,以带毒样品总RNA为模板,RT-PCR扩增得到807 bp目的片段,克隆测序并对其推导的外壳蛋白(CP)氨基酸序列进行同源性分析,并比较分析了不同地区PVA分离物CP氨基酸序列分子变异。结果表明,云南不同地区PVA分离物与GenBank中登录的部分PVA分离物CP氨基酸序列同源性为93.3%～100%,依据不同PVA分离物CP氨基酸序列构建系统进化树,云南PVA分离物与中国福建分离物(AF483279)亲缘关系较近,形成一个进化簇。PVA不同分离物CP氨基酸序列分子变异分析表明,不同分离物CP氨基酸变异位点主要分布在氨基酸序列的N端。     

同一病株西瓜枯萎病菌RAMS分析

利用RAMS(Randomamplifiedmicrosatellites)分子标记技术对河北省不同地区的3个西瓜枯萎病病株分离物Fon1、Fon2、Fon3各10个单孢菌株进行了基因组多态性分析。10个RAMS引物进行扩增,Fon1共扩增出39条带,其中多态性条带9条;Fon2共扩增出40条带,多态性条带5条;Fon3共扩增出40条带,多态性条带4条。结果分析表明,同一病株分离物的不同单孢菌株之间在分子水平上存在遗传差异性。     

侵染野茼蒿引起黄脉症状的联体病毒的分子鉴定*

 采自云南元江的野茼蒿表现为明显的叶脉黄化症状,从中检测到的病毒分离物分别命名为YYJ1,YYJ2,YYJ3。利用已经报道的联体病毒通用引物PA/PB对多株野茼蒿样品进行PCR检测,扩增到约500 bp大小的特异性基因片段。扩增产物序列测定表明,YYJ1,YYJ2 与云南烟草曲叶病毒（Tobacco leaf curl Yunnan virus,TbLCYNV）各分离物的同源性最高,分别为96%,98%。YYJ3与景洪野茼蒿黄脉病毒（Crassocephalum yellow vein virus-Jinghong）的同源性达98%。初步断定云南烟草曲叶病毒与景洪野茼蒿黄脉病毒是侵染元江野茼蒿的两个主要病毒。同时,利用扩增联体病毒卫星DNAβ的引物beta01/beta02对不同染病植株进行检测,未检测到联体病毒的卫星DNAβ。     

马铃薯A病毒在云南省的发生及其P3蛋白序列分析

[目的]了解马铃薯A病毒在云南省的发生分布情况,明确云南省分离物变异情况。[方法]用DAS-ELSIA的方法,检测云南省19个种植马铃薯县(市)的389个样品;对5个地区的阳性样品用RT-PCR扩增马铃薯A病毒P3蛋白基因,克隆测序,使用DN AM AN及DN AStar等软件分析序列,采用MEGA 6.0邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统进化树。[结果]D AS-ELISA检测389个样品,PVA的检出率为20.82%。用P3蛋白基因特异性引物从云南5个不同地区的PVA阳性样品中扩增得到1041bp的目的片段;比较分析了云南省5个地区马铃薯A病毒分离物之间,及与国内外13个分离物的P3蛋白和PIPO蛋白同源性,发现云南省5个地区PVA分离物之间P3蛋白和PIPO蛋白氨基酸序列同源性分别为98.8%～99.7%和97.6%～100.0%;与国内外13个分离物P3蛋白和PIPO蛋白的氨基酸序列同源性分别为90.8%～99.1%和90.5%～100.0%。系统进化树显示,云南省5个分离物与湖南省分离物(KF977085)亲缘关系最近;PVA马铃薯分离物和新西兰树番茄分离物之间亲缘关系较远。[结论]PVA在云南省发生普遍;云南省马铃薯A病毒存在一定程度的变异;PVA存在一定的寄主适应性。     

河南省番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定及序列分析

从河南省9个地市蔬菜大田内采集到49份表现番茄黄化曲叶病毒病(tomato yellow leaf curl disease,TYLCD)典型黄化及曲叶症状的番茄样品,为了明确引起TYLCD的病原,利用双生病毒简并引物PA/PB对49份番茄样品进行PCR检测.结果表明,从32份样品中扩增得到约500 bp的特异性片段,阳性检出率为65.3％.随机选择番茄HNAY3、HNKF2、HNXY1、HNLY1、HNNY1、HNXC2、HNXX1及HNSQ1样品进行DNA-A全基因组扩增及克隆测序,结果表明,DNA-A全长均为2 781 nt,具有典型的双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒的基因组结构特征,共编码6个ORFs.聚类分析表明,这8个分离物与我国已报道的番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)各分离物亲缘关系较近.这些结果表明,引起河南省大田番茄上TYLCD的病原是TYLCV.     

番茄黄化曲叶病毒山东泰安分离物的全基因组克隆与分析

2011年春季在山东泰安保护地采集疑似番茄黄化曲叶病毒病症状的样品(SDTA),利用双生病毒的通用引物及DNA-A基因的全长引物对样品进行扩增并测序,得到共2 781 bp的核苷酸序列。序列比对发现,该样品与番茄黄化曲叶病毒安徽分离物(FN650807)同源性最高为99.6%,系统进化树表明,该样品是番茄黄化曲叶病毒,属于番茄黄化曲叶病毒以色列株系。     

河南省大蒜病毒病的分子检测

为了明确引起河南省大蒜病毒病的病原,采用RT-PCR方法对采集的表现矮缩症状的大蒜样品分别用5对引物进行检测,结果表明,在大蒜样品中同时检测到洋葱黄矮病毒(onion yellow dwarf virus,OYDV)、韭葱黄条病毒(leek yellow stripe virus,LYSV)和青葱潜隐病毒(shallot latent virus,SLV)3种病毒,没有检测到大蒜普通潜隐病毒(garlic common latent virus,Gar CLV)和青葱X病毒(allexiviruses)。根据测序结果进行序列和遗传进化分析发现,河南省OYDV分离物与SLV分离物在进化树上都单独形成一分支,其中OYDV与其他分离物的核苷酸同源性为94.8%~96.9%,SLV与其他分离物的核苷酸同源性在86.5%~88.5%,河南省LYSV分离物与墨西哥分离物的同源性达到99.4%,亲缘关系最近。试验中同时检测到3种病毒,说明河南省大蒜病毒病为多种病毒复合侵染。