贵州番茄黄化曲叶病毒的检测及其DNA-A序列分析

【目的】明确侵染贵州番茄的番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)分离物与其他地区TYLCV的系统进化关系,为贵州番茄黄化曲叶病毒病的防控提供科学依据。【方法】将采自贵州省关岭县的番茄疑似TYLCV样品提取DNA,用菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)通用引物BegoAFor1/BegoARev1进行PCR检测,并用TY3/TY5引物扩增并克隆TYLCV贵州分离物的DNA-A全长序列,分析序列同源性及系统进化情况。【结果】从病样中分离得到的致使贵州番茄叶片表现黄化、皱缩等症状的病原为TYLCV,通过构建系统进化树可知,TYLCV贵州分离物(TYLCV-GZ)的DNA-A与TYLCV-Mexico和TYLCV-XJKS的相似性最高,核苷酸一致性达99%以上,其与国内其他地区TYLCV分离物归属一致,属于TYLCV-IL株系,且与TYLCV-SDLC(山东)和TYLCV-XJKS(新疆)聚在一个分支上,说明其亲缘关系最近。【结论】引起贵州关岭县番茄叶片黄化、皱缩的病原为番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV),且属于TYLCV-IL株系。     

山西省运城市番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定

从山西省运城市表现黄化曲叶典型症状的番茄植株上分离得到病毒分离物SXYC-X4(KY499720),对其DNA-A的全基因组进行序列分析。结果表明,SXYC-X4的DNA-A全长为2 781 bp,共编码6个开放阅读框。通过序列比对发现,SXYC-X4与山东省潍坊市的病毒分离物(KC999850)和河南省焦作市的病毒分离物(KX034543)的同源性较高,均为99. 5%,确认SXYC-X4是番茄黄化曲叶病毒。系统进化分析结果表明,该病毒分离物属于番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,简称TYLCV)-Isreal株系,与烟草曲茎病毒(tobacco curly shoot virus,简称Tb CSV)在AC4氨基酸序列上的同源性高于部分TYLCV,推测在自然界中TYLCV与Tb CSV在AC4序列处可能已经发生了广泛的重组,TYLCV有可能会获得更强的致病性,应提高警惕。     

番茄黄化曲叶病毒辽宁葫芦岛分离物的检测和序列分析

采用已报道的菜豆金色花叶病毒属的通用引物PA/PB,从辽宁葫芦岛地区的3份番茄样品中扩增到Begomoviruses的保守区域,获得3个长度约500 bp的克隆序列,同源性为99.58%.DNA-A全基因组序列分析结果显示,3份样品DNA-A全长均为2 781 bp(分别命名为LNhud1、LNhud2和LNhud3分离物),具有典型双生病毒结构,与番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)山东分离物(TYLCV-[CN:SD:SDWF-L7:12],KC999850)的核苷酸同源性最高(99.6%).根据双生病毒分类标准,认为LNhud1、LNhud2和LNhud3是TYLCV的辽宁分离物.系统关系树表明,这3个分离物属于TYLCV-Isreal株系.     

福州番茄黄化曲叶病毒的全基因组结构特征

为明确引起福建省福州市长乐地区番茄上曲叶症状的病原,提取样品总DNA,利用简并引物PA/PB进行PCR扩增,从10个样品中均可扩增到500 bp左右的特异条带.NCBI BLAST序列比对表明,该序列与番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)核苷酸序列相似性最高,达99.0%.再根据已知500 bp序列设计1对反向引物,扩增TYLCV分离物Fz01全基因组近全长,克隆并测序.经序列拼接发现,TYLCV分离物Fz01基因组全长2781 nts(KP685598),与已报道的TYLCV其他各分离物相似性均在89.3%以上,而与来自中国不同地区的TYLCV分离物的相似性均在98.7%以上.因此,Fz01属于TYLCV的一个分离物.     

番茄黄化曲叶病毒安徽分离物的基因组结构特征及变异分析

利用滚环扩增（RCA）技术从安徽淮北番茄温室表现曲叶症状的番茄上获得番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）的2个分离物全基因组。 2个TYLCV DNA-A核苷酸序列全长均为2 781 nts,共编码6个ORF。序列比对结果表明,2个TYLCV安徽分离物DNA-A核苷酸序列同源性为99.7%,与已报道的国内外其他24个TYLCV各分离物同源性高达97.8% ~ 99.9%。系统进化分析显示,TYLCV安徽分离物与来自吉林、沈阳、天津、邯郸和山东的5个TYLCV分离物亲缘关系最近。     

侵染河南省番茄的番茄黄化曲叶病毒及伴随卫星DNA分子的基因组特征

从河南省长葛市的番茄病株上分离到4份病毒分离物HNCG1、HNCG2、HNCG3和HNCG4,为明确病原类型及其亲缘关系,首先采用检测双生病毒的简并引物进行检测,均能从样品中扩增出约500 bp的片段,4个序列同源性达99%。对HNCG4基因组DNA-A全序列测定表明,其全长为2 781 bp,与番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)省内分离物(HNSQ1、HNNY1、HNLY1、HNQX)及其临近省份的河北分离物(TYLCV LF)、北京分离物(TYLCV BJ3)亲缘关系较近,序列同源性均达99%。进一步研究发现,HNCG1和HNCG4均伴随有1 347 bp的卫星DNAβ,而HNCG2和HNCG3中未检测到DNAβ。序列比对结果表明,HNCG1和HNCG4的DNAβ之间序列同源性为100%,与越南TYLCV分离物DX2的卫星DNAβ序列同源性最高,达88%。根据以上结果,引起河南省长葛市番茄黄化曲叶病的病毒为TYLCV,部分分离物伴随有卫星DNA分子。     

番茄黄化曲叶病毒侵染危害海南番茄及其分子特征

[目的]明确引起海南三亚、东方和陵水番茄黄化曲叶病的病毒分子特征,为防控该病害提供科学依据.[方法]以2019年2月从海南三亚、东方和陵水采集的15份疑似番茄黄化曲叶病样本为材料,采用菜豆金色花叶病毒属病毒的通用简并引物AV494/CoPR对15份样本进行PCR检测,并对PCR检测为阳性的样本进行滚环扩增(RCA)及基因克隆,获得侵染海南三亚、陵水和东方番茄的病毒基因组全序列,进而在GenBank数据库BLASTh程序进行相似性比对,利用SDT 1.2的MUSCLE alignment进行序列相似性比较分析,采用MEGA 6.0的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育进化树,明确所获得病毒分离物与已报道分离物的亲缘关系.[结果]获得侵染海南三亚、陵水和东方番茄的3个番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)分离物基因组全序列,其大小均为2781 nt,编码6个开放阅读框(ORF),其中病毒链上AV1和AV2基因,互补链上AC1、AC2、AC3和AC4基因.相似性比对分析结果表明,TYLCV海南分离物与墨西哥和美国分离物的相似性在99.0%以上,与来自我国不同省(市)的14个TYLCV分离物的相似性在98.0%以上.系统发育进化分析显示,海南三亚、陵水和东方3个分离物与墨西哥、美国及我国北京和江苏分离物聚集在一个小分支,进一步与来自我国其他12个省(市)、韩国、哥斯达黎加和澳大利亚的分离物形成一个分支.[结论]侵染海南番茄的TYLCV可能来自我国大陆的番茄等种苗和烟粉虱带毒传入,也有可能来自墨西哥和美国等其他国家.     

四川番茄黄化曲叶病病原分子鉴定及变异分析

 【目的】明确引起四川番茄黄化曲叶病（Tomato yellow leaf curl disease,TYLCD）的病原。【方法】对采自四川攀枝花市田间表现矮化、黄化和曲叶症状的番茄植株SC64-67,通过PCR、克隆及测序等技术获得病毒及卫星DNA的全基因组序列,并对序列进行变异分析。【结果】利用双生病毒简并引物PA/PB从4个样品中均扩增得到约500 bp的片段,随机选择SC65进行DNA-A全基因组扩增和序列测定,该DNA分子全长为2 732 nts,系统进化分析表明,其与已报道的中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV）来自云南元谋的菜豆分离物（TYLCCNV-Bean-YM）的核苷酸序列相似性最高,为96.0%。检测发现,所有分离物均伴随有卫星DNAβ分子。全序列测定表明SC65 DNAβ全长1 338 nts,与分离自云南楚雄番茄上的TYLCCNV-Y25伴随的卫星DNAβ亲缘关系最近,核苷酸序列相似性为77.5%。【结论】研究表明四川番茄黄化曲叶病样品均受到TYLCCNV/DNAβ病害复合体的侵染,但其病毒DNA-A和卫星DNAβ分子来源于TYLCCNV的不同分离物。     

番茄黄化曲叶病毒山东泰安分离物的全基因组克隆与分析

2011年春季在山东泰安保护地采集疑似番茄黄化曲叶病毒病症状的样品(SDTA),利用双生病毒的通用引物及DNA-A基因的全长引物对样品进行扩增并测序,得到共2 781 bp的核苷酸序列。序列比对发现,该样品与番茄黄化曲叶病毒安徽分离物(FN650807)同源性最高为99.6%,系统进化树表明,该样品是番茄黄化曲叶病毒,属于番茄黄化曲叶病毒以色列株系。     

山东寿光地区番茄黄化曲叶病毒株系的分子鉴定

本试验对山东寿光地区两份番茄病毒病样品进行分子鉴定,结果证明山东寿光地区番茄感染的病毒为番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)。对两病毒样品的DNA-A(该病毒总基因组)全长序列进行测定分析,发现两样品病毒DNA-A全长序列共有2 781个核苷酸,两序列同源性达99.9%以上,很可能为同一分离物。将此序列经nucleotide blast(核苷酸序列比对程序)比对后分析发现该序列与我国上海、安徽等地报道的番茄黄化曲叶病毒序列同源性在99.0%以上,且山东寿光地区番茄黄化曲叶病毒应为TYLCV-Israel株系的分离物。     

安徽淮北番茄曲叶病的病原鉴定初报

采用分子手段鉴定了安徽淮北番茄曲叶病的病原.从安徽淮北番茄温室采集番茄叶片样本,用CTAB法从番茄叶片中提取总DNA.利用简并引物PA、PB进行PCR扩增,从大部分样本中扩增出双生病毒500 bp特异性条带.将扩增片段克隆并测序,该片段序列全长541 bp,与我国报道的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)各个分离物序列相似性均很高,达到95.9%～99.4%,可以初步明确侵染安徽淮北番茄的双生病毒为番茄黄化曲叶病毒(TYLCV).安徽淮北TYLCV 500 bp片段序列与山东TYLCV相似性最高,达99.4%,而且从构建的系统关系树也可以看出,安徽淮北TYLCV与山东TYLCV的亲缘关系最近,推测安徽淮北番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)可能来源于山东.     

河南省番茄黄化曲叶病病原分子鉴定及全基因组序列分析

利用双生病毒简并引物PA/PB对采自河南中牟县13份表现为黄化、曲叶症状的番茄样品进行PCR检测, 结果发现11份样品检测呈阳性,检出率为84.6%.选取样品HN-158,利用滚环扩增PCR(RCA-PCR)、克隆、测 序等技术获得病毒基因组DNA-A全序列,该DNA分子全长为2781nts(登录号JQ004028.1),与已报道的番茄黄 花曲叶病毒Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV山东泰安分离物SDTA(NCBI登录号:JF414236.1)核酸序列 相似度最高,为99.8%.进化分析表明,该病毒分离物与来自菏泽、泰安、济南、石家庄及天津等地的TYLCV 分 离物亲缘关系较近.以上结果表明中牟县田间番茄黄化曲叶病样品均受到TYLCV 侵染,该病毒分离物可能来源 于我国山东番茄上的TYLCV.     

河南省番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定及序列分析

从河南省9个地市蔬菜大田内采集到49份表现番茄黄化曲叶病毒病(tomato yellow leaf curl disease,TYLCD)典型黄化及曲叶症状的番茄样品,为了明确引起TYLCD的病原,利用双生病毒简并引物PA/PB对49份番茄样品进行PCR检测.结果表明,从32份样品中扩增得到约500 bp的特异性片段,阳性检出率为65.3％.随机选择番茄HNAY3、HNKF2、HNXY1、HNLY1、HNNY1、HNXC2、HNXX1及HNSQ1样品进行DNA-A全基因组扩增及克隆测序,结果表明,DNA-A全长均为2 781 nt,具有典型的双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒的基因组结构特征,共编码6个ORFs.聚类分析表明,这8个分离物与我国已报道的番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)各分离物亲缘关系较近.这些结果表明,引起河南省大田番茄上TYLCD的病原是TYLCV.     

番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒复合侵染的分子鉴定

以番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)及番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)为对象,用分子检测方法对山东、安徽2省病原进行鉴定。选取山东、安徽2省7个地区,对2种病毒病进行田间调查,采集疑似样品扩增序列,对其进行同源性比对和遗传进化树等分析,进一步了解山东、安徽2个省蔬菜产区2种病毒病的发生情况。结果表明,YLCV在山东省大部及安徽省局部地区已经发生扩散且中国所有的分离物仍属于IL株系。明确了ToCV在安徽地区发生,且统计发现2个省6个地区ToCV、TYLCV存在单独侵染及复合侵染。ToCV分离物均可分为2个大组,其中该研究所得到的分离物均与中国其他地区的分离物聚类到一组。     

郑州地区2种菊花病毒CP基因的克隆与序列分析

为了探明郑州地区感病菊花上病毒的种类及来源,采集有明显病症的菊花样品,根据已知的番茄不孕病毒(TAV)和菊花B病毒(CVB)的基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR扩增其外壳蛋白(CP)基因的方法对这2种病毒进行了检测,然后进行序列同源性及系统进化分析。结果显示,所得TAV的CP基因序列长度为481 bp,NCBI登录号为KU873003;所得3条CVB的CP基因序列长度均为547 bp,NCBI登录号分别为KU873004、KU873005、KU873006。将郑州分离物的CP基因与NCBI上已登录的其他分离物进行比对,TAV核苷酸序列同源性为91%~99%,氨基酸序列同源性为86%~100%;CVB核苷酸序列同源性为76%~99%,氨基酸序列同源性为77%~99%。系统进化分析表明,菊花TAV郑州分离物与北京分离物KP019201、黑龙江分离物KP019202、河南分离物KP019200和山西分离物KP019204的亲缘关系最近;CVB郑州分离物与印度分离物AJ812569、AJ871367的亲缘关系最近。     

侵染番茄的中国番木瓜曲叶病毒基因组结构特征

从云南元谋采集表现曲叶症状的番茄样品中分离粉虱传双生病毒(Whitefly-transmitted geminivirus,WTGs)分离物YN678。序列分析表明其DNA-A为单链环状,全序列长度为2739 bp,编码6个ORFs。BLAST比对发现,该分离物与双生病毒科菜豆金色黄花叶病毒属的中国番木瓜曲叶病毒HeNZM1分离物(PaLCuCNV-[HeNZM1])最为接近,相似性为98.5%,表明番茄中的分离物YN678是PaLCuCNV的1个分离物。利用WTGs卫星分子DNAβ特异引物Beta01/Beta02进行PCR扩增、克隆和测序,在YN678中扩增到DNAβ分子,全长为1357 bp,该序列与中国番茄黄曲叶病毒YN149分离物(TYLCCNV-[YN149])伴随的DNAβ相似性最高,达到99.1%。这是首次从云南番茄中分离到中国番木瓜曲叶病毒。     

青岛烟草番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定与全基因组序列分析

2016年6月从青岛即墨市中国农业科学院烟草研究所试验基地采集疑似感染番茄黄化曲叶病毒的烟叶样品。提取病叶总DNA,使用双生病毒(Geminivirus)通用引物PA/PB对样品进行PCR扩增和测序,感病叶片DNA仅检测出番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,简称TYLCV);根据测定的部分序列片段,设计了1对全长序列背向引物,对其基因组全长进行克隆测定。结果显示,该病毒核酸为单链环状DNA,基因组为单一组分DNA-A,经过分子比对和系统进化树分析发现,TYLCV-SDQDJM(Gen Bank:KY640456)与山东省潍坊市番茄分离物TYLCV、山东省泰安市番茄分离物TYLCV同源性最高为99%,与已经报道的其他地区TYLCV分离物同源性均在97%以上,因此确定从青岛即墨市采集的烟草矮化病毒症状烟株是由TYLCV侵染所致;同时采集了发病植株以及周边蔬菜保护地部分蔬菜上的烟粉虱成虫进行检测,其中15.0%的烟粉虱样品检出番茄黄化曲叶病毒,因此明确了侵染该地区烟草的番茄黄化曲叶病毒是由带毒烟粉虱传播的。     

山东、安徽两省栽培番茄烟粉虱传双生病毒的PCR检测及序列分析

2008年秋季山东菏泽、安徽淮北保护地栽培番茄上发生了一种新的病害,对两地采集的4份病样进行了分子检测,结果表明4份样品所感染的病毒均属于菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus),同源率在98.7%以上.并对其中代表样品AH1进行了DNA-A克隆和序列分析, 结果表明AH1全长 2 786个核苷酸,共编码6个ORF.基因组比较发现, AH1 DNA-A与浙江省和上海市报道的番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)同源性达到99.3%以上.这是该病毒在安徽、山东两省的首次报道,值得关注.     

新疆加工番茄上番茄花叶病毒的分子鉴定

从表现花叶、畸形的加工番茄病株上获得分离物xj124,用1 对ToMV CP 基因引物进行 RT-PCR ,扩增得到了689 bp 的特异性核苷酸片段.将PCR产物插入到克隆载体pMD1 8-T中再转化到大肠杆菌TOP10.经限制酶酶切鉴定,重组克隆中含有与PCR 产物大小相同的689 bp 的插入片段.cDNA全序列分析表明,所扩增出的689 bp ToMV CP基因,含1个480 bp开放阅读框架( ORF),编码160氨基酸组成的蛋白,所克隆的基因包含完整的ToMV CP基因.所测得的xj124分离物与国内外已报道的部分ToMV CP基因序列比较,核苷酸同源性高达84.4;～99.8;,氨基酸同源性高达98.7;～100;.因此将该分离物鉴定为番茄病毒病花叶病毒.     

设施番茄病毒病病原鉴定

【目的】 研究危害中国新疆和田地区洛浦县设施番茄的病毒种类,为该区域番茄病毒病的科学防治提供依据。【方法】 2019年秋季,在洛浦县设施蔬菜产区采集8份番茄疑似感病样品。利用已报道侵染番茄的7种主要病毒的特异性引物对采集的番茄疑似感病样品进行RT-PCR检测,对番茄褪绿病毒阳性样品的CP基因进行克隆和测序,进行同源性、地理来源和系统进化分析。【结果】 从8份样品中检测到南方番茄病毒病(Tomato yellow leaf curl virus,STV)、番茄黄化曲叶病毒病(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV),其检出率分别为100%、100%、87.5%,未检出烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic Cucumovirus,CMV)、番茄花叶病毒病(Tobacco mosaic virus,ToMV)、番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV)。对ToCV基因进行克隆与序列分析,中国新疆洛浦县分离物的CP基因的774个核苷酸序列与已报道的51个ToCV CP基因具有较高的同源性,与中国其它地区、日本、韩国、希腊、土耳其、巴西等地分离物一致性均在96%以上,中国新疆洛浦县采集病样分离的ToCV CP基因与中国北京、山东分离物的CP基因聚集在1个分支上,亲缘关系较近。【结论】 新疆洛浦县设施番茄疑似病毒病植株的"黄化"现象,由STV、TYLCV和ToCV中的2种或2种以上病毒复合侵染所致,番茄褪绿病毒已传播至新疆和田地区。