黑龙江省大蒜病毒病原鉴定及病毒病发生情况调查

黑龙江省大蒜病毒病的田间症状复杂,研究通过生物学技术、电子显微镜技术和血清学方法相结合对大蒜病毒病原进行鉴定,并对黑龙江省大蒜病毒病的发生情况进行了调查。结果表明,表现花叶症状的大蒜样品中含有韭葱黄条病毒(Leek yellow strape virus,LYSV)和大蒜潜隐病毒(Garlic latent virus,GarLV);表现黄化症状的大蒜样品中含有洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)和大蒜普通潜隐病毒(Garlic common latentvirus,GCLV);表现卷叶症状的大蒜样品中含有GCLV、LYSV和OYDV。黑龙江省大蒜病毒病的发生相当严重,且多数为复合侵染,其中LYSV、GCLV和GarLV的检出率较高。     

应用多重RT-PCR检测甘肃‘成县迟蒜’中的大蒜潜隐病毒和洋葱黄矮病毒

根据大蒜潜隐病毒(garlic latent virus,GLV)和洋葱黄矮病毒(onion yellow dwarf virus,OYDV)的外壳蛋白基因核苷酸序列分别设计2对特异性引物,在单重RT-PCR检测的基础上,建立同时检测GLV和OYDV的多重RT-PCR技术体系.结果表明:该方法可从带病的甘肃‘成县迟蒜’大蒜样品中扩增出GLV(849bp)和OYDV(571bp)的2条特异性片段.GLV扩增产物与GenBank中登录的其他分离物核苷酸同源性在90.00%～99.76%,OYDV扩增产物与其他分离物核苷酸的同源性为90.00%～98.00%.     

中国主要大蒜品种和品系的病毒检测

对 96份大蒜品种和品系进行了病毒病症状及有关农艺学性状观察记载 ,其中 6 6份用 5种病毒抗血清作Dot-ELISA和免疫电镜检测及观察 ,发现大蒜不同品种 (系 )对不同种类病毒侵染存在明显差异 ,84.8%的大蒜品种 (系 )受 2种以上病毒侵染。韭葱黄条斑病毒 (LYSV) ,洋葱螨传潜隐病毒 (OMbFV)和洋葱黄矮病毒 (OYDV)是侵染中国大蒜的主要病毒种类 ,大蒜普通潜隐病毒 (GCLV)和青葱潜隐病毒 (SLV)也有检出     

韭葱黄条病毒黑龙江分离物外壳蛋白基因克隆与序列分析

韭葱黄条病毒(Leek yellow stripe virus,LYSV)是大蒜上的重要病毒病害,几乎分布于全国所有大蒜种植区域,严重影响大蒜的产量和品质。对其建立RT-PCR分子检测体系以及对其外壳蛋白(CP)基因进行序列分析尤为重要。根据已报道的LYSVCP基因的核苷酸序列设计合成1对引物,以带毒植株总RNA为模板,应用RT-PCR方法,克隆了LYSV黑龙江分离物(LYSV-HLJ)CP基因全长cDNA序列。结果表明,LYSV-HLJCP基因全长885bp,编码295个氨基酸残基;与GenBank中其他不同分离物的CP核苷酸序列同源性为79.7%～88.6%,氨基酸序列同源性为83.7%～93.1%。依据LYSVCP氨基酸序列建立系统进化树,将LYSV不同分离物划分为4个类群,LYSV-HLJ与韩国和巴西大蒜上的LYSV有较近的亲缘关系,同属于ⅳ类,表现出一定的寄主相关性。     

河南大蒜韭葱黄条病毒的分子鉴定及其系统进化分析

2019年本研究对河南大蒜病害进行调查时发现当地大蒜病毒病发生比较普遍,为明确病原种类,我们对田间样品进行采集(累计采集疑似病样38份)并利用葱蒜类病毒引物对其进行了RT-PCR检测。结果发现,在用韭葱黄条病毒(Leek yellow stripe virus,LYSV)引物检测时,有33份样品中检测到1条大小为304 bp的目的条带,为了进一步确定检测到的病毒为LYSV,本研究对其外壳蛋白基因(CP)序列进行了克隆,结果发现其序列全长864 bp,编码1个由289个氨基酸组成的相对分子质量约32 300的蛋白质。CP基因序列构建的系统进化树结果分析显示,其与LYSV其他分离物共同聚类到1个大分支,表明该病毒属于LYSV的1个分离物;同时序列分析结果也显示LYSV分为2支,本研究检测到的LYSV河南分离物与中国其他分离物共同聚类到1个分支,其中与中国厦门等地分离物同源性最高,而与之前检测到的河南分离物同源性相对较低。这些结果表明本研究在河南大蒜中检测到的病毒是韭葱黄条病毒,虽然之前在河南也有该病毒侵染大蒜的报道,但本研究检测到的分离物与之前报道的分离物之间差异比较大,暗示河南大蒜上可能出现了新的LYSV类型或株系,生产上应当重视。     

嘉定白蒜的病毒检测

为明确嘉定白蒜在种植区的病毒情况,从嘉定白蒜两个种植基地采样,分别提取总RNA,然后反转录。采用RT-PCR方法检测洋葱黄矮病毒(OYDV)和大蒜普通潜隐病毒(GCLV)。结果表明:根据GCLV中间保守序列设计3对特异性引物,在两处样品中均分别扩增到300、710和450bp片断。将其中450bp片断克隆后测序。测序结果与GenBank上的GCLV基因序列比对,发现其同源性达到95%。由此确认嘉定白蒜中含有GCLV。根据OYDV中间保守序列设计5对引物,在两处样品中均未扩增到可检测的片断,表明嘉定白蒜中不含OYDV。     

贵州百香果病毒病病原的鉴定

【目的】鉴定侵染贵州百香果的病毒病病原种类,为建立分子检测和防控体系提供理论依据。【方法】采集贵州百香果主要种植地疑似感病的百香果样叶,利用去真核生物核糖体rRNA构建测序文库,对疑似病毒侵染的样品进行高通量测序和病毒种类鉴定。【结果】样本中含有夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus, TeMV)、东亚西番莲病毒(East Asian Passiflora Virus, EAPV)和西番莲潜隐病毒(Passiflora latent virus, PLV),占比分别为1.59%、63.65%和34.72%。TeMV和EAPV贵州分离物与已报道分离物的核苷酸序列一致性分别为87.6%～99.7%和85.2%～99.8%。PLV贵州分离物CP基因核苷酸序列一致性为99.5%～100%,与已报道分离物核苷酸序列一致性为93.0%～95.4%。系统进化分析表明,PLV分离物单独形成1个分支,相同地区的分离物优先聚集在一起,表现出较强的地域性。【结论】侵染贵州百香果的病毒病病原主要是TeMV、EAPV和PLV。     

乐都紫皮大蒜4种病毒多重RT-PCR检测技术的建立

【目的】建立乐都紫皮大蒜4种病毒的多重RT PCR快速检测方法,为大蒜病毒病病原鉴定、脱毒效果验证等提供技术支撑。【方法】根据乐都紫皮大蒜RNA全长转录组测序结果,分别设计洋葱黄矮病毒（onion yellow dwarf virus,OYDV）、大蒜潜隐病毒（garlic latent virus,GLV）、大蒜D病毒（garlic virus D,GarVD）和大蒜X病毒（garlic virus X,GarVX）4种病毒的外壳蛋白特异性引物,筛选不同引物,优化引物用量、模板用量、退火温度等条件,并进行了多重RT PCR的灵敏度检测和12份引进栽培大蒜种质资源的病毒检测。【结果】通过优化筛选,在一个PCR反应体系中实现了OYDV（1 232 bp）、GLV（831 bp）、GarVD（506 bp）和GarVX（116 bp）4种病毒的多重检测,最优反应条件为退火温度55 ℃,模板用量2.5 μL,混合引物用量1.0 μL。多重RT PCR的灵敏度略低于单一RT-PCR。对引进的12份栽培大蒜资源进行4种病毒的多重RT-PCR检测发现,有5份资源存在4种病毒,4份资源存在2种病毒,3份资源存在1种病毒。对7份资源中经多重PCR未检测到的病毒,使用单一RT-PCR进行检测和验证发现,除1份内蒙古资源（NMG）的1种病毒（GarVX）外,多重RT PCR结果与单一RT-PCR检测结果一致。【结论】本研究建立的大蒜多重RT-PCR体系可靠性强,可用于大蒜病毒的检测与防控     

如何防止茶陵紫皮大蒜种性退化

<正>茶陵紫皮大蒜是特色农产品,以香、辣、脆而享誉国内外。而近些年来,茶陵紫皮大蒜种性退化相当严重。茶陵紫皮大蒜种性退化的主要原因是病毒侵害。通过对茶陵紫皮大蒜取样进行病毒检测,发现主要病毒有大蒜潜隐病毒(GLV)、韭葱黄条病毒(LYSV)、洋葱黄矮病毒(OYDV)和大蒜病毒(GV)。从2013年起,茶陵县农业局与株洲市农业科学研究所进行了合作,利用茎尖脱毒技术进行脱毒和种球繁殖。其主要技术路径:选取品质较好的种球进行茎尖脱     

Detection of GLV, OYDV and LYSV in potato onion （Allium cepa L., Aggregatum group） by RT-PCR

Three pairs of primers were designed and synthesized from nucleotide sequences of garlic latent virus (GLV), onion yellow dwarf virus (OYDV), and leek yellow stripe virus (LYSV) by using PCR primer design software. The expected fragments about 170 bp, 287 bp, and 191 bp were amplified by RT-PCR for GLV, OYDV, and LYSV, respectively in disease-infected plants of potato onion (Allium cepa L., Aggregatum group), but such fragments were not obtained from healthy-looking plants and virus-free seedlings of shoot-tips. The amplified products of GLV, OYDV and LYSV were cloned into pGEM-T vectors, and transformed into Escherichia coli. JM109. The recombinant plasmids were obtained and sequenced. The nucleotide sequences were compared with corresponding viral nucleotide sequences reported in GenBank by performing a NCBI BLAST. The analysis showed that their homology attained 75% to 90%,89.5% to 96.1%,and 91.6% to 96.3% in GLV, OYDV, and LYSV, respectively. The total RNA of 6.34 μg·μL~(-1) from infected plants was diluted to a series of 10~(-1) to 10~(-5) and the detection sensitivity of RT-PCR was 10~(-4) (about 4 ng). Thus, a method of identification and detection by RT-PCR of GLV, OYDV, and SLYV was established.     

大蒜茎尖组培苗的检测

从市售阿城紫皮蒜生长的叶片经ＰＥＣ沉淀差速离心提纯,获得复合病毒制剂,得率为４．９０ｍｍ（１００ｇ）－１叶。电镜观察病毒粒体为长度５５０～８００ｎｍ的线状物,经抗血清测定主要为洋葱黄矮病毒（ＯＹＤＶ）和大蒜潜隐病毒（ＧＬＶ）。用复合病毒制剂免疫制备的抗血清效价为１０２４～２０４８。ＯＹＤＶ抗血清检测茎尖脱毒组培苗,脱毒率为５０％左右,用ＧＬＶ抗血清检测,脱毒率为９５％～９７％,复合病毒抗血清检测结果与ＯＹＤＶ相同。证明复合病毒抗血清可用于组培苗的检测。组培脱毒大蒜在田间种植１年后发病率为５０％,３年后达８０％。茎尖组培脱毒率不高。需用抗血清逐株检测挑选,淘汰病苗,才能获得健康无毒的大蒜群体。     

郑州地区小麦黄矮病病原鉴定及其外壳蛋白的分子进化分析

为了明确郑州地区小麦黄矮病病原种类及其分子变异情况,根据已公布的小麦黄矮病致病毒株GAV,GPV和PAV的外壳蛋白(CP)全长基因序列,采用RT-PCR方法鉴定了来自郑州地区的4个分离物种类,并进行了基于CP序列的郑州分离物与6个国内和3个国外分离物的进化关系分析.结果表明,郑州地区的4个分离物均鉴定为BYDV-PAV(命名为PAV-ZZ),其编码的CP与国内及国外的分离物,在核苷酸水平上的一致性为81%～99%.PAV-ZZ CP与济南分离物一致性最高,核苷酸水平上达99%;与昆明和德国、瑞典、美国分离物一致性较低,核苷酸水平上仅为81%.这表明BYDV-PAV郑州分离物与北方地区的病毒分离物可能有着相似的系统进化特征,而与南方地区及国外分离物在系统进化上有较大的差异.     

山东小麦黄花叶病毒的分子检测与鉴定

利用RT-PCR对2012年山东10个地区送检的105个小麦样品进行了检测,从泰安、临沂、枣庄3个地区的样品中检测到了小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)。这3个地区WYMV分离物CP基因的核苷酸一致率为97.6%～98.3%,氨基酸一致率为98.3%～99.0%。在利用CP基因核苷酸序列构建的系统进化树中,这3个分离物均与WYMV分离物聚类到一起,其中枣庄分离物和河南分离物(FR828007)亲缘关系更近。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒河南09分离株ORF5基因的克隆及结构分析

参照GenBank上登录的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)美洲型AF494042株ORF5基因序列,设计1对特异性引物,应用RT-PCR扩增出PRRSV河南09分离株(HN-09)的ORF5基因,经与pGEM-T Easy载体连接后,筛选出阳性重组质粒进行序列测定,并利用DNASTAR软件对序列进行分析.结果表...     

甘肃省河西地区菜豆病毒病分子检测

以采集自甘肃省河西地区表现病毒病症状的菜豆病株叶组织总RNA为模板,进行RT-PCR扩增,鉴定出苜蓿花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、菜叶普通花叶病毒、黑眼豇豆花叶病毒4种病毒.对预期大小的扩增产物进行直接测序.结果表明:该地区菜豆病毒病的发生以苜蓿花叶病毒、黑眼豇豆花叶病毒和小西葫芦黄花叶病毒复合侵染为主.