中华蜜蜂mrjp3基因cDNA的克隆及序列分析

 以东方蜜蜂（Apis cerana）mrjp3基因部分片段为探针筛选中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）8日龄工蜂头部cDNA文库，得到120个阳性克隆。对这些阳性克隆进行进一步的筛选和序列测定，获得含有中蜂MRJP3 (AccMRJP3)cDNA的阳性克隆，对阳性克隆的插入片段进行测序，得到AccMRJP3的cDNA序列全长。中蜂MRJP3的cDNA全长为1 987 bp（包括10 bp长的poly A尾巴），包含一个长1 779 bp，编码593个氨基酸的ORF，在5'端和3'端各有一个长46 bp和160 bp的非编码区。类似于西方蜜蜂（Apis mellifera）和大蜜蜂（Apis dorsata），由AccMRJP3 cDNA编码的氨基酸序列也存在一个长片段重复区。但比较结果显示中蜂、西方蜜蜂、大蜜蜂MRJP3重复区之间存在一定差异。     

小麦逆境胁迫相关基因TaC2DP1的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,并对其序列特征、进化关系和表达特性进行分析,探讨该基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能,为进一步解析植物的抗逆机制提供候选基因和理论依据。【方法】以cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列为探针,对小麦EST数据库进行搜索,筛选与探针同源性在97％以上的EST序列,通过电子克隆结合RT-PCR获得该基因cDNA全长,采用生物信息学软件分析比较克隆基因的保守结构域及序列特征;采用MEGA6.0软件构建该基因的系统进化树;将测序正确的该基因片段通过EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pMAL-c2X,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导1-5 h后,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析该基因在小麦不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高温和ABA处理下的表达模式。【结果】成功获得小麦cDNA全长序列,命名为TaC2DP1。该基因序列全长为1 356 bp,包含一个1 209 bp的开放阅读框（ORF）,5′端非编码区50 bp,3′端非编码区97 bp,编码402个氨基酸,推导编码蛋白质的预测分子量为43.41 kD,等电点为4.30,属于酸性蛋白,BLAST分析表明,该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域,称为C2结构域（C2-domain）。多序列比对及进化树分析表明,TaC2DP1与乌拉尔图小麦TuC2亲缘关系最近,二者具有高度的同源性,其编码的氨基酸一致性达到91%;蛋白质结构预测分析显示TaC2DP1无跨膜螺旋和双硫键,亚细胞定位于细胞质中;成功构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-TaC2DP1,在IPTG诱导下得到90 kD左右的蛋白,与理论值一致。通过实时荧光定量PCR进行TaC2DP1表达分析,显示该基因在小麦的根、茎、叶、幼穗、未成熟籽粒、胚及胚乳中均有表达,其中在幼穗中表达量最高,在花后5 d籽粒中表达量最低。TaC2DP1可被植物激素ABA诱导而上调表达;干旱胁迫过程中,TaC2DP1受胁迫诱导呈稳定上调表达趋势;高温和低温胁迫过程中,TaC2DP1均在胁迫后的0.5 h迅速诱导上调表达,分别为对照的21和17倍。推测该基因可能参与小麦ABA 信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦TaC2DP1的全长序列,其编码蛋白含有与钙离子结合的C2结构域;在低温、干旱、高温和ABA逆境胁迫下,TaC2DP1属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,可能在干旱、低温和热胁迫中发挥重要作用。     

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame, ORF) 1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。     

红光熊蜂触角感受器扫描电镜观察及气味受体基因BiOr119的克隆与表达分析

旨在克隆红光熊蜂气味受体基因、分析蛋白质结构特性与理化性质,确定其在工蜂不同组织、不同发育阶段表达量的差异。以红光熊蜂工蜂为材料,采用扫描电镜观察其触角感受器,RT-PCR技术扩增获得气味受体基因cDNA序列,采用生物信息学软件分析编码蛋白质的结构特性,MEGA7.0软件邻接法构建氨基酸同源性系统进化树;采用实时定量PCR技术分析红光熊蜂气味受体基因 BiOr119在工蜂不同组织(触角、头、胸、腹、足和翅)、不同发育阶段的差异表达情况。结果表明,工蜂触角具4种感受器,即板型感受器、锥状感受器、毛型感受器和腔型感受器; BiOr119基因开放阅读框(ORF)长1 077 bp,编码358个氨基酸,分子质量为41.48 ku,理论等电点(pI)7.04,是一种稳定的碱性疏水蛋白;含有6个跨膜结构(7tm-6),蛋白氨基端位于膜内;氨基酸同源性分析,BiOr119与地熊蜂BtOr9a一致性高达96.2%; BiOr119基因在同日龄下触角的基因表达量极显著高于其他组织(P0.01),腹部表达量最低。综上所述, BiOr119具有昆虫气味受体的典型特征。     

绒山羊RORα基因2种亚型的结构与进化分析

为深入研究绒山羊RORα基因的结构及功能,利用cDNA末端快速扩增法（RACE）结合转录组获得了绒山羊（Capra hircus）维甲酸相关孤核受体（retinoic acid receptor-related orphan receptorα,RORα）基因的2个亚型:RORα1和RORα2（GenBank登录号分别是HM₀61155和HM₃58053）。序列分析表明,RORα1序列全长1 620bp,包括5′端非翻译区（untranslated region,UTR）29bp、3′端非翻译区211bp和开放阅读框（open reading frame,ORF）1 380bp,共编码459个氨基酸,分子质量约为52.3ku,理论等电点6.25。RORα2序列全长1 694bp,包括5′UTR 76bp、3′UTR 211bp和ORF 1 407bp,共编码468个氨基酸;与人RORα4的长度相同,相似性达99%,分子质量约为53.4ku,理论等电点为6.37。结果显示:1)RORα1氨基酸序列缺少大多数核受体具有的调节区（A/B区）,预测的二级结构少一个β-折叠基序（YFV）;2)RORα的DNA结合区到配体结合区部分属于纯化选择,A/B区在长度和序列方面变异都很大。     

青花菜P450CYP79F1全长克隆、表达及其与不同器官中莱菔硫烷含量的相关性分析

【目的】克隆青花菜细胞色素家族P450CYP79F1,分析其序列特征,阐明其在不同发育时期器官中的表达情况及其与莱菔硫烷含量的关系,为进一步揭示莱菔硫烷合成机理提供科学依据,为青花菜品种改良和新品种选育奠定基础。【方法】通过5′和3ˊ端RACE克隆技术获得青花菜CYP79F1全长序列,利用DNAMAN 6.0进行基因拼接、氨基酸序列分析和蛋白二级结构预测,结合在线分析程序和软件进行基因和编码蛋白生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术研究CYP79F1在不同发育器官中的表达情况;结合HPLC方法测定各相应时期器官中莱菔硫烷含量,包括青花菜发育时期的根、茎、叶,成熟花球,抽薹期花蕾（顶端蕾、成熟蕾、开花前1 d的蕾和花）和种子;对CYP79F1表达量与和莱菔硫烷含量进行相关性分析。【结果】获得了CYP79F1全长序列,GenBank登录号为MG012890,该基因全长2 014 bp,包含一个1 620 bp的开放读码框（ORF）,编码540个氨基酸;编码的蛋白与甘蓝、白菜、芥蓝和油菜等同源蛋白的相似性均在95%以上;生物信息学分析表明该基因编码的酶蛋白有2个信号肽和2个跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质中;CYP79F1在根和茎中的表达量较高,叶中表达量最低,在花器官发育时期,自顶端蕾到花发育过程中呈现逐渐降低的表达趋势,种子中该基因表达量与花处于同一水平。Pearson相关性分析显示,青花菜发育时期的根、茎、叶、成熟花球、抽薹期花蕾和种子中莱菔硫烷含量与CYP79F1表达量无显著相关关系,但抽薹期花蕾自顶端花蕾到花中莱菔硫烷生成量与CYP79F1表达量呈显著正相关关系（R=0.96,P<0.05）,CYP79F1在调控莱菔硫烷的生成方面起重要作用,尤其是在生殖器官花蕾的发育过程中,能够显著上调莱菔硫烷的生成量。【结论】CYP79F1在青花菜不同发育器官中对莱菔硫烷的生成发挥着重要调控作用,可能与青花菜不同器官中莱菔硫烷含量多样性密切相关。     

西花蓟马气味结合蛋白的cDNA克隆、序列分析及时空表达

【目的】鉴定西花蓟马(Frankliniella occidentalis)气味结合蛋白（odorant binding protein,OBP）并对其序列特征及分布情况进行研究,为阐明该虫嗅觉识别的机制、利用干扰昆虫嗅觉识别来进行害虫防治提供依据。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆西花蓟马气味结合蛋白基因,用DNAMAN软件进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并用MEGA6.0的邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树,应用服务器Chou & Fasman预测蛋白的二级结构,通过实时荧光定量PCR检测该基因在西花蓟马不同发育期以及成虫不同组织中的分布情况。【结果】克隆了一个西花蓟马气味结合蛋白基因,命名为FoccOBP1（GenBank登录号：KM527948）;该基因cDNA序列全长660 bp,其中开放阅读框450 bp,编码149个氨基酸,3′端非编码区长172 bp,具有真核生物polyA加尾结构,5′末端非编码区长38 bp,预测成熟蛋白分子量为16.39 kD,等电点为7.46,N端有22个氨基酸组成的信号肽序列,具有气味结合蛋白典型的6个保守半胱氨酸位点特征,其排列方式为C1-X₂₆-C2-X₃-C3-X₄₀-C4-X₉-C5-X₈-C6,符合典型OBP 6个保守的半胱氨酸位点结构模型。氨基酸序列中有3个亲脂性区域,第74-83位的氨基酸残基形成的亲脂性口袋尤为明显,可能是脂溶性气味分子的结合位点;FoccOBP1氨基酸序列与3个半翅目和10个同翅目昆虫OBP聚在同一分支,其中与绿盲蝽（Apolygus lucorum）的AlucOBP8（GenBank登录号为AFJ54049.1）、苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）的AlinOBP5（GenBank登录号为ACZ58031.1）、牧草盲蝽（Lygus lineolaris）的LlinOBP2（GenBank登录号为AHF71029.1）同源相似性最高,其次是棉蚜（Aphis gossypii）的AgosOBP7（GenBank登录号为AGE97637.1）、大豆蚜（Aphis glycines）的AglyOBP7（GenBank登录号为AHJ80893.1）、禾谷缢管蚜（Rhopalosiphum padi）的RpadOBP7（GenBank登录号为AHL30243.1）等昆虫的OBP,表明FoccOBP1与这些基因的亲缘关系也较近;经FoccOBP1蛋白的二级结构预测,FoccOBP1以α-螺旋为主,其次是β-折叠,转角含量较少;经不同发育阶段检测发现,FoccOBP1在西花蓟马若虫期和初羽化成虫期的表达量较高,且随成虫羽化后天数的延长表达量逐渐降低,在雌雄成虫间的表达量也有差异;在初羽化成虫的不同组织检测发现,FoccOBP1几乎在初羽化成虫触角中特异性表达;构建了重组表达质粒pET-30a/FoccOBP1。【结论】明确了FoccOBP1的核苷酸、氨基酸序列特征,分析了该蛋白的二级结构特征,根据FoccOBP1在西花蓟马中的时空表达情况,推测该基因可能在西花蓟马嗅觉识别、定位寄主植物、信息素合成或性行为方面扮演重要角色;成功构建了重组表达质粒pET-30a/FoccOBP1,为下一步该蛋白表达纯化及其功能的深入研究打下基础。     

黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3 的cDNA全长克隆和序列分析

采用RT-PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物（CMV-PE）全长RNA3.经核苷酸序列测定，明确PE分离物 RNA3全长2216 nt，含有2个开放阅读框（ORF），其中5'端的ORF（121-963 nt）编码279 aa的3a蛋白，3'端ORF（1260-1916 nt ）编码218 aa的CP蛋白.5'端非编码区（NR）长120 nt,基因间隔区（IR）长296 nt，3'端NR区含301个碱基.PE分离物编码的3a蛋白中最明显的特征是在136-141位有一个独特的VWCLSS区域.将CMV-PE的RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属CMV亚组I的其它分离物进行比较，发现症状相似的CMV分离物的非编码区具有很高的序列同源性，说明非编码区序列与症状有关.     

苹果抗性相关的谷胱甘肽转移酶基因MdGSTU1的生物信息学和表达分析

【目的】克隆苹果（Malus domestica Borkh.）中抗苹果轮纹病相关的编码谷胱甘肽转移酶基因MdGSTU1,研究其在不同组织器官及不同逆境处理条件下的表达特性,为解析该基因的抗逆功能奠定基础。【方法】基于抗轮纹病相关的EST序列,通过在NCBI进行比对,得到一个谷胱甘肽转移酶（GST）基因相关的EST片段;然后在苹果基因组数据库中进行比对,获得该GST的编码框序列（coding sequence,CDS）,同时,设计RACE引物,克隆该基因的UTR序列;利用MEGA5.0软件对该GST蛋白与拟南芥GST家族蛋白成员进行系统进化树分析,使用DNAMAN软件对该蛋白的分子量、等电点等进行预测,并对其氨基酸序列进行分析;采用荧光定量PCR检测该基因在不同组织中的表达以及该基因在盐、模拟干旱和苹果斑点落叶病原菌处理条件下的表达特性;克隆该基因的启动子,利用PlantCARE软件在线分析该基因启动子上的顺式作用元件。【结果】进化树分析显示该GST与拟南芥中GST家族的U亚家族成员亲缘关系最近,故被命名为MdGSTU1;MdGSTU1的CDS为666 bp,编码221个氨基酸残基,其蛋白分子量为25.41 kDa,等电点为5.28;RACE结果显示该基因3'UTR区域为135 bp;蛋白序列及结构分析显示,其与拟南芥GST家族蛋白相同,该蛋白也包含保守的谷胱甘肽-S-转移酶的N端及C端结构域;PCR结果显示,MdGSTU1在根、茎、叶、花、果各组织中均有表达,但根中的表达水平最高,同时,该基因能够被150 mmol·L^-1 NaCl和20%的PEG诱导表达,均在1 h时表达量达到最高值;另外,苹果斑点落叶病原菌也能诱导MdGSTU1的表达,表达量在病菌处理8 h时达到最大;启动子分析显示MdGSTU1启动子区域含有多个抗性相关的作用元件,其中包括ABA响应元件、厌氧响应元件、GA响应元件、SA响应元件、JA响应元件以及防御和逆境响应元件;此外,该启动子上还包含多个MYB转录因子结合位点。【结论】MdGSTU1属于植物tau亚家族（GSTU）成员,生物及非生物逆境胁迫均可诱导该基因的表达。     

橘小实蝇羧酸酯酶基因BdCAREB1的克隆及其表达模式解析

【目的】在克隆获得橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）1条羧酸酯酶基因全长序列的基础上,解析该基因在橘小实蝇不同发育阶段和组织以及经高效氯氰菊酯饲喂后的表达模式。同时结合之前完成的有关橘小实蝇羧酸酯酶生化特性以及增效剂处理研究结果,综合分析橘小实蝇羧酸酯酶对高效氯氰菊酯作用的应激反应,为明确羧酸酯酶对菊酯类杀虫剂的解毒代谢机制奠定基础。【方法】通过同源序列比对的方法,从橘小实蝇转录组数据中筛选出1条羧酸酯酶基因序列片段,利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）扩增得到该基因的全长cDNA序列;应用生物信息学分析软件对该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列、分子量等信息进行预测,并基于最大似然法构建该基因与其他昆虫相关基因序列的系统发育树,阐明其分子生物学特征。此外,分别提取橘小实蝇不同发育阶段以及3龄幼虫的中肠、脂肪体、马氏管和气管等组织的RNA,在内参基因稳定性评估筛选的基础上,运用qPCR的方法解析该基因在不同发育阶段和组织间以及药剂处理后的表达模式。【结果】从橘小实蝇转录组数据库中筛选出1条长度为1 028 bp的羧酸酯酶基因片段,通过对5′端和3′端进行RACE扩增分别得到长度为1 073和625 bp的目的片段,经序列拼接和验证后,确定该基因全长为1 872 bp,完整开放阅读框1 710 bp,编码569个氨基酸,推测其蛋白质分子量为63.3 kD,理论等电点6.38。该基因经序列比对命名为BdCAREB1,GenBank登录号为KF539980。基于最大似然法构建的系统发育树显示,该基因编码的蛋白质与双翅目昆虫的羧酸酯酶具有高度的同源性。分析其在不同发育阶段的表达模式发现,BdCAREB1在3龄幼虫期的表达量最高,其次为成虫期,而在卵期的表达量最低。在橘小实蝇3龄幼虫不同组织间的定量分析结果表明,BdCAREB1在脂肪体中表达水平最高,其次在中肠和马氏管的表达水平较低且接近,而在气管的表达量最低。经饲喂0.33 μg?g-1（药剂/饲料）的高效氯氰菊酯后检测BdCAREB1在整虫及组织间的表达情况发现,该基因在幼虫以及脂肪体中的表达量显著上调。【结论】橘小实蝇BdCAREB1的表达具有发育阶段和组织特异性,在幼虫期和脂肪体的表达量最高,并对高效氯氰菊酯处理表现出明显的应激反应,具有可诱导性。结合此前完成的橘小实蝇羧酸酯酶活性测定及增效剂研究结果,分析该基因很可能参与橘小实蝇对高效氯氰菊酯的解毒代谢。     

大足黑山羊PHLDA2基因的克隆、组织表达与印记状况分析

【目的】克隆大足黑山羊PHLDA2（pleckstrin homology-like domain, family A, member 2）基因序列,分析其组织表达特征、印记状况以及与胎盘性状的关系,为深入研究该基因在山羊胎盘中的功能积累数据。【方法】根据人、牛和猪PHLDA2的保守区域设计引物以RT-PCR方法扩增大足黑山羊该基因部分cDNA序列,进一步利用5′-和3′-RACE技术获得全长cDNA序列;利用ORF Finder和ProtParam等在线工具分析PHLDA2基因序列特征;采用Real-time PCR方法分析PHLDA2在大足黑山羊心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、脂肪、舌和胎盘等10个组织的表达差异;寻找大足黑山羊和波尔山羊PHLDA2基因序列SNP位点,基于表达SNP的方法分析该基因在F₁代组织中的印记状况;采用线性回归的方法分析PHLDA2表达量与胎盘性状的关系。【结果】克隆得到935 bp大足黑山羊PHLDA2的cDNA全长序列,其中5′-UTR、3′-UTR和编码序列分别为62 bp、450 bp和420 bp,其编码140个氨基酸。预测的山羊PHLDA2蛋白分子量大小为15 638.7 Da,等电点为9.18,二级结构由α-螺旋(37.14%)、β-转角(9.29%)、延伸链(23.57%)和无规卷曲(30%)组成, 并且包含保守的PH（pleckstrin homology）结构域。③BLAST分析发现,山羊PHLDA2定位于29号染色体,其与牛、猪、猕猴、马和人同源基因核苷酸序列的相似性分别达到91%,90%,90%,90%和89%,在核苷酸和氨基酸序列上与牛的亲缘关系最近。④荧光定量PCR结果显示PHLDA2在山羊胎盘中表达量最高（P < 0.01),在心、肝、肺、肾、肌肉、脂肪、舌和大脑组织中表达量很低且差异不显著（P > 0.05), 在脾中未检测到表达。⑤印记分析表明,PHLDA2在初生山羊胎盘、心脏和肝脏组织表达母源等位基因,但在肺、大脑和肌肉组织为双等位基因表达。⑥PHLDA2表达水平与山羊胎盘重回归关系显著（n = 15,R²=0.855,P <0.01）。【结论】山羊PHLDA2基因序列和结构特征具有物种间的保守性,但是其印记状况具有组织特异性; PHLDA2为山羊胎盘的生长和功能调控的重要基因。     

苹果NADP依赖的苹果酸酶基因克隆、序列和表达分析

【目的】克隆苹果（Malus×domestica B.）中苹果酸代谢的关键酶基因MdNADP-ME,进行序列特征分析,研究MdNADP-ME在苹果中组织表达的情况。【方法】利用RT-PCR技术获得苹果MdNADP-ME1,2,3全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用荧光实时定量PCR技术研究MdNADP-ME1,2,3的组织表达。【结果】测序结果显示,获得的3个NADP-苹果酸酶基因（MdNADP-ME1、MdNADP-ME2 和 MdNADP-ME3; GenBank 登录号为JX971883、JX971884和JX971885）,其ORF分别为1 512、1 782和1 926 bp,推测其分别编码503、593和641个氨基酸的多肽。氨基酸序列和结构分析显示,这3个基因均含有5个保守的氨基酸区域（motif I-V）,含有2个功能结构域：malic和NAD_bind_1_malic_enz。进化树分析结果显示,MdNADP-ME1 和MdNADP-ME2属于双子叶植物细胞质NADP-ME型,MdNADP-ME3属于双子叶植物质体NADP-ME型。荧光实时定量PCR结果表明,MdNADP-ME1-3在被检测的组织中均有表达,但表达差异明显。【结论】MdNADP-ME1-3属于植物NADP-ME家族,结构高度保守,并且在苹果的不同组织中有不同表达模式。     

洋葱花器官B类MADS-box基因AcPI的克隆及表达分析

【目的】克隆洋葱花器官B类PI/GLO家族MADS-box基因,分析其序列特征及时空表达模式,为探讨其在洋葱花发育过程中的分子遗传机制奠定基础。【方法】以洋葱花蕾总RNA为模板,根据同源克隆策略设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得AcPI的全长cDNA序列。用生物信息学方法对其基因序列特征进行分析;利用RT-PCR和Real-time PCR分析AcPI在花蕾整个生长过程中的时空表达模式。【结果】克隆获得洋葱AcPI基因（GenBank登录号：JX679083）的cDNA全长931 bp,包含615 bp的完整开放阅读框,编码205个氨基酸。蛋白分析表明,AcPI蛋白具有植物MADS-box蛋白典型的MADS和K结构域;与水仙的NTPI、风信子的HoMADS2有78%、75%的相似性,与金鱼草的GLO也有52%的相似性。系统进化树分析表明,AcPI属于B类MADS-box蛋白家族的PI亚家族。RT-PCR表达分析表明,AcPI只在生殖器官花蕾中表达,但主要在花的第一、二、三轮花器官中表达,而在营养组织根、茎和叶中不表达。Real-time PCR进一步分析表明,AcPI在花芽整个生长过程中,在心皮中微弱表达,但表达丰度呈递增趋势;而在外轮被片、内轮被片和雄蕊中强烈表达,其表达丰度除了在外轮被片中呈先增后减的趋势外,在内轮被片和雄蕊中都呈递增趋势。【结论】AcPI在洋葱第一轮花器官中的表达支持了van Tunen提出的修正的ABC模型;但AcPI在洋葱第四轮花器官中也有表达,这表明AcPI除了调控外轮被片、内轮被片和雄蕊发育外,还可能在心皮的形成发育过程中起着重要作用。     

甘蔗可溶性酸性转化酶（SoSAI1）基因的克隆及表达分析

【目的】克隆甘蔗可溶性酸性转化酶基因（SoSAI1）全长cDNA序列和5?侧翼启动子序列,并分析其序列特征和基因表达模式。【方法】利用RACE技术克隆SoSAI1的全长cDNA序列,应用生物信息学软件分析SoSAI1预期编码蛋白特征;采用Genome Walking技术克隆SoSAI1的启动子序列;采用实时荧光定量PCR分析不同生长期SoSAI1在甘蔗叶和茎中的表达,以及PEG 6000、100 mmol•L-1 NaCl和6℃胁迫下,SoSAI1在甘蔗苗期根和叶中表达模式。【结果】SoSAI1的cDNA序列全长为2 387 bp,ORF长2 058 bp,编码685个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为74.44 kD和5.6,GenBank登录号为JQ406875。5?侧翼启动子序列长417 bp,含有胚乳特异表达顺式作用元件和参与干旱诱导的MYB结合位点,GenBank登录号为KC862314。SoSAI1表达在生理成熟期的花序和花序轴中较高,而在成熟茎和老茎中较低。15%PEG和6℃能诱导叶中SoSAI1表达,而15%PEG和NaCl能诱导根中SoSAI1表达。【结论】获得SoSAI1全长cDNA序列和部分启动子序列,SoSAI1在甘蔗生长发育和蔗糖积累,并在应对环境胁迫中发挥作用。     

绿盲蝽超气门蛋白ALUSP的克隆、原核表达及纯化

【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因（ALUSP）,获得原核表达的重组蛋白,为ALUSP的功能研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物,获得ALUSP的保守序列;再通过设计特异性引物,利用RACE方法,分别克隆ALUSP 5′及3′段序列,然后通过拼接获得ALUSP全长序列;应用生物信息学方法,对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析,建立系统进化树;将含有ALUSP的T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP,将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进行诱导表达,再通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析后获得ALUSP功能区纯化蛋白。【结果】ALUSP开放阅读框长1 005 bp,编码334个氨基酸,预测分子量56.63 kD,理论等电点8.42;序列特征分析表明,该基因翻译后的蛋白质具有超气门蛋白的典型特征,由A/B域（249 bp）、C域（198 bp）、D域（69 bp）和E域（489 bp）组成,其中C域高度保守,包含2个锌脂结构并含有1个P-盒和1个D-盒,且含有由8个氨基酸构成的核定位信号,D域含有1个识别DNA元件的T-盒,E域含有1个由8个α螺旋和1个β折叠形成袋状结构;氨基酸比对结果表明,ALUSP的氨基酸序列与稻绿蝽USP序列一致性最高（57.82%）,与其他昆虫的USP序列一致性较低,如膜翅目的Melipona scutellaris（46.05%）、Scaptotrigona depilis（45.94%）;系统进化树分析结果显示,半翅目与膜翅目、直翅目等昆虫的USP较为分化,位于不同分支,ALUSP与稻绿蝽USP进化关系最近,可能来源于共同的祖先。EcoR I和Xho I双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pEGX-6P-1载体上,命名为pEGX6P1-ALUSP;经37℃、1.0 mmol•L-1的IPTG诱导的pEGX6P1-ALUSP重组质粒可特异性表达1个约65 kD的蛋白,并且该重组ALUSP蛋白主要以包涵体形式存在;收集含有目的基因的菌株进行GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析,最后进行复性和纯化后在65 kD附近仅出现1条清晰的特异性条带,表明已得到纯化的靶蛋白。【结论】克隆了ALUSP全长,其具有昆虫超气门蛋白的典型特征,并获得了原核表达的重组蛋白。     

月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的克隆及表达分析

【目的】克隆月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的全长cDNA序列,分析其序列及表达特征,并对该基因编码的蛋白进行原核表达分析,为深入探讨丁香酚合成酶的生化特性奠定基础。【方法】根据已发表的其它植物EGS基因序列的保守结构域设计简并引物,结合RACE技术,获得RhEGS1的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期RhEGS1进行表达分析。采用Gateway克隆技术,构建原核表达载体,并进行原核蛋白表达。【结果】月季RhEGS1 的cDNA全长为1 207 bp,包含一个927 bp的ORF,编码309个氨基酸。同源序列比对发现RhEGS1与仙女扇的CbEGS2有83.87%的同源性,与矮牵牛PhEGS1具有81.55%同源性。表达谱分析表明,RhEGS1主要在雄蕊中表达, 且在花盛开期表达最强,而在花蕾期及凋谢期表达较弱。原核表达分析发现,在37℃、0.5 mmol•L-1 IPTG 诱导4 h 后,携带RhEGS1 ORF 的原核表达载体在大肠杆菌中生成了大量的分子量约为35 kD 的蛋白质,其分子量大小与预测的理论值相一致。【结论】从月季雄蕊中克隆到丁香酚合成酶基因RhEGS1,具有EGS基因的结构特征和完整的编码框,且在盛开期雄蕊中表达量最高。     

亚洲玉米螟两种漆酶基因OfLac1和OfLac2 cDNA 的克隆及基因表达

【目的】克隆亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）漆酶-1（OfLac1）和漆酶-2（OfLac2）基因;研究OfLac1和OfLac2在亚洲玉米螟不同发育阶段和不同组织中的表达特异性;分析蜕皮激素处理亚洲玉米螟后OfLac1和OfLac2基因表达量的变化;比较OfLac1和OfLac2表达模式的差别,推测其生理功能。【方法】根据已知的其他昆虫中Lac-1和Lac-2的保守氨基酸序列分别设计引物,以亚洲玉米螟白蛹时期提取的RNA反转录合成的cDNA为模板,通过PCR扩增OfLac1和OfLac2的保守区。然后根据所得的保守区片段分别设计基因特异性引物,采用RACE方法分别克隆OfLac1和OfLac2的3′和5′端序列,通过拼接获得OfLac1和OfLac2的基因全长。收集5龄第4天亚洲玉米螟的表皮、中肠、脂肪体、丝腺、气管、马氏管、精巢7种不同组织材料,通过半定量PCR分析OfLac1和OfLac2在不同组织中的基因表达模式。收集从卵到成虫29个不同生长发育时期的亚洲玉米螟作为材料,采用实时荧光定量PCR分析OfLac1和OfLac2在不同发育时期的基因表达水平。选取5龄第2天亚洲玉米螟幼虫进行蜕皮激素注射,分别在1、4、8、12和24 h后取样,利用实时荧光定量PCR研究OfLac1和OfLac2在蜕皮激素诱导下的基因表达水平。【结果】克隆获得亚洲玉米螟OfLac1和OfLac2的 cDNA序列。OfLac1全长3 065 bp,其中5′非编码区222 bp,3′非编码区440 bp,开放阅读框2 403 bp,共编码800个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为90.6 kD,理论等电点pI为5.34;OfLac2全长3 405 bp,其中5′非编码区162 bp,3′非编码区960 bp,开放阅读框2 283bp,共编码760个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为84.0 kD,理论等电点pI为6.43。通过SignalP分析发现,OfLac1在N端包含一个长为22个氨基酸的信号肽,OfLac2在N端包含一个长为23个氨基酸的信号肽,均为分泌蛋白质。基因表达模式分析表明,在发育过程中,OfLac1主要在成虫中表达,在其他发育时期表达量较低;OfLac2在每个幼虫龄期的末期表达水平上调,在幼虫化蛹过程中的预蛹期表达量最高;在不同组织中,OfLac1在马氏管和中肠中表达量最高,在气管和表皮中的表达量较低,在精巢、丝腺和脂肪体中几乎不表达;OfLac2在中肠和丝腺中表达量最高,在气管和表皮中的表达量较低,在精巢、马氏管和脂肪体中几乎检测不到表达。将蜕皮激素20E注射到亚洲玉米螟体内,OfLac1在注射24 h后表达量明显上调,OfLac2在注射12 h后表达量开始上调,在24 h后上调最明显。【结论】克隆得到亚洲玉米螟两种漆酶OfLac1和OfLac2的cDNA序列。两种漆酶基因的表达模式存在明显差别,但都受蜕皮激素的调控。OfLac2可能参与蜕皮过程表皮褐化。     

鸭血清白蛋白基因克隆及其在病毒感染过程中的表达变化

【目的】克隆鸭血清白蛋白（duck serum albumin,DSA）基因,并对其进行生物信息学分析和mRNA表达规律研究。【方法】以前期抑制性消减杂交技术筛选的白蛋白（albumin,ALB）基因为候选基因,通过构建雏鸭肝炎病毒和聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid,Poly(I:C))感染模型,利用RT-PCR、RACE技术和基因组步移技术分别克隆ALB基因cDNA序列和5′侧翼序列,并对其进行生物信息学分析;同时利用RT-qPCR检测ALB基因各组织时空表达量。【结果】①ALB cDNA全序列长为2 107 bp,包括47 bp的 5′UTR、212 bp的 3′UTR和1 848 bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）;其5′侧翼序列具有典型的TAAT box、CAAT box以及HSF、HNF、C/EBP等多个肝脏富含的潜在转录因子结合位点;②RT-qPCR显示,ALB mRNA 呈肝脏组织特异性表达,且在雏鸭肝炎病毒和Poly(I:C)等抗原刺激后,肝脏组织ALB mRNA表达量总体表现水平为先上升后下降,24 h后保持在稳定水平。【结论】成功克隆了鸭ALB基因cDNA和5′侧翼序列,该基因在不同禽类（鸡、鸭、火鸡）中表现为相当保守,主要在肝脏组织中表达,且在雏鸭肝炎病毒和Poly(I:C)感染下,ALB mRNA表现水平为先上升后下降。     

黄曲条跳甲JH诱导蛋白基因的克隆与表达分析

【目的】克隆黄曲条跳甲保幼激素诱导蛋白（Juvenile hormone-inducible protein,Ps-jhip-1）基因,并分析其表达特征。【方法】克隆黄曲条跳甲Ps-jhip-1基因,对其进行系统发育分析,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。利用荧光定量PCR方法分析Ps-jhip-1基因在黄曲条跳甲不同组织器官及1个生物钟周期内表达量的变化趋势。【结果】成功克隆了Ps-jhip-1全长cDNA,其长度为1 252 bp,开放阅读框为1 230 bp,编码409个氨基酸。Ps-jhip-1基因编码蛋白具有典型的类蛋白激酶C超家族的蛋白功能域,不具备保幼激素膜受体分子的特征。系统发育分析结果表明,Ps-jhip-1与同为鞘翅目昆虫赤拟谷盗的8种JH诱导蛋白基因聚为一支。荧光定量PCR结果表明,Ps-jhip-1基因mRNA在黄曲条跳甲雌雄成虫的多种组织器官中都有表达,其中在触角和头部的表达量相对较高,而在中足和后足的表达量相对较低,约为触角表达量的6%;Ps-jhip-1基因mRNA表达水平在1个生物钟周期内存在4个下调表达时段,但并未表现出明显的节律性特征。【结论】成功克隆了黄曲条跳甲Ps-jhip-1基因,并分析了其在不同组织及1个生物钟周期内表达量的变化。