葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

谷子和狗尾草WOX转录因子基因的全基因组鉴定与分析

WOX转录因子主要功能涉及植物组织发育、器官形成和干细胞维持等。为了深入研究谷子和狗尾草WOX转录因子基因家族,为后续狗尾草属植物生长发育相关WOX基因的克隆和功能研究奠定理论基础,研究鉴定了谷子和狗尾草WOX转录因子家族基因,并进行了生物信息学分析。结果表明,谷子和狗尾草基因组分别包含13,12个WOX基因,谷子和狗尾草共有12对直系同源基因,这些同源基因具有相似的基因结构,谷子和狗尾草WOX基因内含子相位为0或1;谷子和狗尾草WOX基因蛋白质基序Motif 1,Motif 3,Motif 4和Motif 5较为保守;SiWOX1等基因启动子包含AACA_motif,CAT-box,GCN4_motif,RY-element等元件,说明它们可能参与调控胚乳或种子发育、或分生组织形成;SiWOX11和SvWOX10这2个基因在根组织中表达量非常高,说明这2个基因可能与根系发育密切相关。     

谷子SiARGOS1的克隆、表达分析和功能标记开发

【目的】从谷子中分离受激素诱导表达、参与器官大小控制的拟南芥ARGOS(Auxin-regulated gene involved in organ size)基因家族的同源基因,进行生物信息学分析,明确其在不同组织器官及其受植物激素诱导的表达模式,分析基因编码区及其启动子序列差异,开发功能标记,为谷子产量性状相关基因的改良提供依据。【方法】通过对已有ARGOS蛋白保守结构域进行BLAST,明确谷子ARGOS家族成员数目并进行蛋白序列分析,采用同源克隆方法获得谷子ARGOS家族成员之一——SiARGOS1编码区及其启动子序列,用生物信息学方法分析SiARGOS1启动子的顺式作用元件,通过实时荧光定量PCR分析该基因在谷子各器官中以及不同植物激素条件下的诱导表达模式,利用基因编码区及启动子序列的SNP和插入缺失序列开发分子标记,同时利用85份谷子品种的穗重(panicle weight,PW)、穗粒重(grain weight,GW)和千粒重(thousand-grain weight,TGW)等产量性状数据进行基因型间的差异显著性分析,挖掘用于检测该基因与谷子产量性状相关优异等位变异的功能标记。【结果】获得6个谷子ARGOS家族成员,均具有典型的保守OSR(organ size related)结构域,包含2个跨膜螺旋结构和1个高度保守富含亮氨酸区域,克隆了与拟南芥AtARGOS同源的家族成员之一——SiARGOS1编码区及其启动子序列,该基因位于谷子第8染色体上,开放阅读框为342 bp,无内含子,编码113个氨基酸,启动子区域为2 109 bp,含有与生长素、乙烯、茉莉酸和赤霉素等多种植物激素调控有关的元件。表达分析发现,SiARGOS1在谷子根、茎、叶和穗等器官中均有表达,在根中表达量最高,其次为茎和叶,穗中表达量最低。SiARGOS1对生长素吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)不敏感,但受乙烯利(ethephon,ETH)上调表达。不同基因型谷子SiARGOS1序列分析发现,SiARGOS1编码区151 bp(起始密码子83 bp)处存在1个SNP(C/G),导致该基因第28个氨基酸发生突变(Ala/Gly),据此设计一个CAPS-AccⅡ标记;另外,启动子区存在19个SNP和2个In Del,根据-1 652—-1 651处(TA)_(2/3)和-1 165—-1 163处(TCA)_(1/2)的序列差异分别设计SSR引物AP-1和AP-2。同时,用这些标记对85份谷子品种进行检测,CPAS-AccⅡ和AP-1检测到不同基因型的穗重、穗粒重和千粒重的差异均不显著,而AP-2检测的2种基因型间除千粒重差异不显著外,穗重和穗粒重在2015和2016两年间差异均达到显著水平。【结论】在谷子中发现6个ARGOS家族成员,均具有保守OSR结构域,其中,谷子SiARGOS1开放阅读框为342 bp,无内含子,与拟南芥AtARGOS同源,该基因对生长素不敏感,但受乙烯利上调表达。在该基因启动子区开发的SSR标记AP-2可作为功能标记,用于谷子穗重和穗粒重等产量性状相关优异等位变异的鉴定和筛选。     

谷子淀粉结合域蛋白基因家族序列特征及干旱胁迫响应表达分析

[目的]谷子属于耐旱杂粮作物,但谷子响应干旱胁迫的相关基因分子机制仍不清楚。为了明确谷子干旱胁迫是否与淀粉代谢关键酶基因相关,探索谷子抗旱的分子机制。[方法]运用生物信息学初步分析了谷子该家族基因的基本序列特征、启动子元件预测。构建该基因家族直系同源系统进化树,分析与其他物种同源蛋白的亲缘关系。基于数字基因表达谱数据分析了PEG模拟干旱条件下,该基因家族在谷子抗旱品种‘勾勾母鸡咀’和敏感性品种‘晋汾16’的表达特征。[结果]谷子全基因组调查表明该基因家族有五个成员,暂且命名为SiSBD1、SiSBD2、SiSBD3、SiSBD4和SiSBD5。序列分析表明,该基因家族成员编码的蛋白序列长度范围为360~949个氨基酸残基;蛋白分子量范围为39~108kD,蛋白质等电点为4.18~6.72。启动子元件分析鉴定出与抗旱相关的顺式作用元件,主要包含:与MYB抗旱基因调控相关,与MeJA、ETH、SA、ABA等在抗旱中起重要作用的植物激素相关,与植物防御和非生物胁迫响应相关。系统进化树表明,谷子SiSBD1基因与高粱和玉米同源蛋白SBD聚为一类,谷子SiSBD2基因与玉米SBD2、SBD3基因的聚为一类,其他3个基因归为一类。进一步分析PEG胁迫下谷子淀粉结合域蛋白基因家族表达,结果表明:SiSBD1在抗旱品种‘勾勾母鸡咀’中表达增加,在敏感性品种‘晋汾16’中表达降低,而其他4个基因的表达在这两个品种中均降低。[结论]该研究结果暗示了淀粉代谢关键酶SDB基因家族与干旱胁迫相关,可为谷子抗旱育种提供一定的理论基础。     

水稻谷氨酰胺合成酶同工型基因转录表达量与启动子结构关系分析

研究选用籽粒蛋白质含量差异显著的5个品种(系),比较分析品种间GS同工型基因在灌浆过程中籽粒和叶片表达特性及启动子序列与结构特点。结果表明,不同品种间OsGS同工型基因表达量差异显著;OsGS1;1和OsGS1;2基因在籽粒和叶片中大量表达;OsGS1;3和OsGS2基因分别仅在籽粒和叶片中大量表达;在灌浆过程中籽粒和叶片中OsGS同工型基因m RNA表达量均呈单峰曲线变化,灌浆前期m RNA表达量平稳升高,中期出现峰值,后期快速降低,且高蛋白质含量品种m RNA表达量高于低蛋白质含量品种。籽粒蛋白质含量差异显著品种间OsGS同工型基因启动子序列同源性高达99%以上;品种间有性杂交子代OsGS同工型基因启动子序列可发生碱基变化,但启动子核心元件无变化。在调控元件数量和功能上OsGS同工型基因启动子保守性很强,启动子在结构和功能上不易发生遗传变异,籽粒OsGS同工型基因m RNA表达量变化受OsGS基因启动子调控影响较小。     

籽粒高效特异性表达启动子的克隆与表达分析

启动子是调控基因表达的重要元件,本研究从燕麦中克隆了燕麦球蛋白基因的启动子序列,经过比对发现新克隆的启动子序列长960 bp,与参考序列AY795082存在9个SNPs。对启动子组成元件进行分析表明,该启动子含有胚乳特异表达所必须的5个Skn-1(GTCAT)基序;在启动子的正链第622 bp和830 bp处存在胚乳表达相关的顺式调控元件GCN4;在启动子的正链550 bp和负链869 bp处有两个O_2位点,曾在玉米中被验证为醇溶蛋白代谢顺式调控元件;在启动子的869 bp处有一个回文结构ACATGTCATCATGT,该序列是胚乳特异表达所必需的。除了上述与胚乳特异性表达有关的元件,该启动子序列中还有许多与逆境响应有关的序列元件。利用上述启动子驱动GUS基因表达试验证明,该启动子启动功能基因表达的强度约为参考序列的5倍,为利用转基因技术改良小麦籽粒性状提供了良好的基因表达驱动元件。     

谷子胁迫诱导型启动子SiRLK35P的分离及生物信息学分析

本研究以谷子"豫谷1号"为材料,结合相关数据库检索,以谷子幼苗提取的基因组DNA为模板,经PCR特异扩增SiRLK35上游1 893 bp调控序列,命名为SiRLK35P。结合PLACE数据库,对SiRLK35P进行生物信息学分析,并对其诱导表达情况进行了预测。结果显示,SiRLK35P中含有ABRELATERD1(ACGT)、GCCCORE(GCCGCC)等多种顺式作用元件,部分元件已知与不同逆境胁迫及应答相关,预测该启动子可能参与谷子胁迫响应,调控下游基因在胁迫等逆境条件下的表达水平,从而对谷子在胁迫下的应答进行调控。该研究为定向改良谷子抗逆特性、培育谷子抗逆新品种提供了候选材料。     

水稻OsTFL2基因启动子的克隆及功能验证

[目的]克隆水稻TFL2(OsTFL2)启动子序列,并分析其结构和功能,为深入研究OsTFL2基因对水稻开花和花发育的调控机理提供理论参考.[方法]采用同源克隆方法克隆OsTFL2基因启动子序列,利用PLACE和PlantCARE分析其结构和功能,并将其连接至携带β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的pCAMBIA1301载体以构建pCAMBIA1301-Pro-moter植物表达载体,通过农杆菌介导转化水稻品种农垦58愈伤组织,通过对转基因植株进行GUS组织化学染色以分析该基因启动子的表达特性和调控功能.[结果]克隆获得的OsTFL2基因起始密码子上游启动子序列1.8 kb,该序列除含有真核生物典型启动子元件TATA-box和CAAT-box外,还含有花粉特异识别的顺式作用元件Pollen1lelat52(AGAAA)、开花基因转录相关的多功能转录因子CACTFTPPCA1(PACT,Y=C/T)、CCAAT box1(CCAAT)、DOFCORE(AAAG)和GATA box(GATA)、分生组织特异性元件CCGTCC-box及多个光诱导元件或光诱导相关元件如G-box、Box I、CATT-motif、GATA-motif和GT1-motif等,推测OsTFL2基因通过上述作用元件参与调控水稻花发育及开花.通过PCR检测共筛选获得16株阳性转基因植株,对其进行GUS组织化学染色,结果发现水稻的外颖、花、花药、柱头和子房中均可检测到明显的GUS色斑,而在叶片、茎尖和根尖无明显的GUS色斑,说明OsTFL2启动子能驱动GUS基因在水稻外颖、花药和子房中表达.[结论]OsTFL2基因启动子具有启动活性和组织表达特异性,可在一定程度上影响OsTFL2基因表达,对水稻花生长发育和开花发挥重要调控作用.     

麻疯树JcFAD7基因启动子克隆及植物表达载体构建

利用TAIL-PCR技术成功克隆了麻疯树JcFAD7基因起始密码子的上游1926bp序列。利用生物信息学手段对其序列特征和潜在的调控元件进行分析表明,该序列含有4个TATA-box和6个CAAT-box,还包含光响应元件、MYB结合位点、不同的激素反应元件以及各种胁迫响应元件,说明JcFAD7的表达可能受多种因素的调控。将启动子连接到pBI101.1载体,成功构建了驱动报告基因GUS的植物表达载体。为阐明麻疯树不饱和脂肪酸的合成代谢过程和植物生长发育的调控机理奠定了基础。     

水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的克隆及表达分析

利用5′-RACE方法克隆了在水稻与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)互作过程中下调表达的水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的全长序列。通过生物信息学方法分析了该基因及编码蛋白质的结构特征,OsCtBP-A由424氨基酸组成,N端具有2-Hacid_dh_C保守结构域,C端具有植物CtBPs家族特有的NLS和PEST基序,氨基酸序列与拟南芥和牵牛花CtBPs同源物的同源性为63%;基因启动子区推测具有ABA和SA应答调控元件。OsCtBP-A基因对不同信号分子应答的RTQ-PCR分析表明,水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(ETH)和脱落酸(ABA)处理水稻后均能诱导该基因的转录表达,但诱导能力有所差异,其中ABA诱导活性最强。     

谷子SnRK2家族基因的生物信息分析

[目的]植物SnRK2是一类蔗糖非酵解型蛋白激酶,在信号转导和非生物胁迫及生长发育中具有非常重要的作用。[方法]本文利用生物信息学的方法从谷子基因组中分析鉴定出10个SnRK2基因,并对这些基因的染色体分布、理化性质、内含子-外显子结构、系统进化和顺式调控元件进行了分析。[结果]谷子的SnRK2基因分布在基因组中不同的染色体上,外显子数目大多为9个。这些基因被分为3个亚组,且与拟南芥和水稻的分类一致。而且,这些基因的上游启动子序列含有多个不同的激素和非生物逆境应答顺式元件,这说明它们在逆境应答和激素信号转导中具有一定的功能。[结论]本文为进一步研究谷子SnRK2基因在非生物胁迫和激素应答中的作用奠定了基础。     

谷子GATA基因家族的鉴定及表达分析

本研究从谷子基因组水平鉴定出33个SiGATA成员,命名为 SiGATA1～ SiGATA33。利用生物信息学方法对谷子SiGATA家族的系统发育、基因结构、染色体分布、保守基序、蛋白三级结构和顺式调控元件进行预测和分析。结果表明,33个SiGATA转录因子被划分为3组,不均匀的分布在8条染色体上,多数含有CX_2CX_(18)CX_2C保守结构域;谷子GATA蛋白与单子叶植物水稻的同源性大于其他两种单子叶植物;蛋白三级结构分析表明,整体结构相似度存在差异,同组进化序列基因的结构相似度较高;顺式作用元件分析表明,SiGATAs启动子序列中存在调控生长发育、激素信号传导和逆境胁迫响应元件,其中 SiGATA15、 SiGATA22、 SiGATA31在干旱、厌氧诱导及脱落酸响应等元件中表达量较高,其在谷子生长发育及逆境响应过程中可能发挥了重要生物学功能。这些逆境响应及生长发育相关转录因子的挖掘,将为作物育种提供一定理论参考。     

植物凝集素SMLII 基因启动子的克隆及序列分析

根据已克隆的丹参植物凝集素SMLII基因cDNA序列,利用染色体步移技术克隆出SMLII 启动子区序列,并进行生物信息学预测分析该基因的功能,结果得到了该基因上游1023 bp的启动子序列（GenBank AccessionNo: KF193867）。分析表明,在该序列中不但含有真核生物典型的核心启动子区TATA-box、CAAT-box,而且含有一些特有的上游启动子元件ABRE、ARE、ASF1MOTIFCAMV、HSE、IBOXCORE、WBOXATNPR1等重要的顺式调控元件及一些光反应相关元件。     

百脉根LjIPT3启动子的克隆及表达载体的构建

[目的]为深入研究LjIPT3的表达调控和功能奠定基础。[方法]利用TAIL-PCR技术克隆百脉根IPT基因LjIPT3起始密码子的上游序列,利用生物信息学手段对其序列特征和潜在的调控元件进行分析,并构建启动子表达载体。[结果]利用TAIL-PCR技术成功克隆了LjIPT3基因5′端上游调控序列。将目的片段连接到pMD18-T载体上,获长度为1 910 bp序列,其3′端有部分序列与LjIPT3的5′端相同,证明克隆的片段为LjIPT3起始密码子ATG的上游区域。该序列含有1个TATA-box和3个CAAT-box,还包含光响应元件、MYB结合位点、不同的激素反应元件以及各种胁迫元件,说明该基因的表达可能受多种因素的调控。成功构建了驱动报告基因GUS的植物表达载体。[结论]该研究为研究植物细胞分裂素的合成代谢和植物生长发育的调控奠定了基础。     

水稻黄嘌呤脱氢酶基因OsXDH克隆及表达分析

[目的]克隆水稻黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase,XDH)基因(OsXDH),分析其生物信息学特性及表达特性,为研究XDH在水稻生长发育和响应逆境胁迫中的调控机制提供理论依据.[方法]以粳稻品种日本晴为材料,采用同源克隆技术克隆OsXDH基因,应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行分析.利用实时荧光定量PCR (qPCR)检测OsXDH基因的组织表达特性及逆境胁迫下的表达情况,并对不同转基因株系乳熟期剑叶OsXDH基因表达量、XDH活性和叶绿素含量进行比较分析.[结果]克隆获得OsXDH基因的开放阅读框序列(ORF)(GenBank登录号LOC4333171),其长度为4110 bp,编码1369个氨基酸.OsXDH蛋白分子量大小为150.23 kD,理论等电点(pI)为6.54,与小麦、高粱、玉米、谷子和油菜等作物XDH蛋白氨基酸序列的相似性分别为84.54%、84.07%、81.52%、76.35%和69.22%,表明XDH蛋白氨基酸序列具有高度保守性.OsXDH基因在水稻不同组织部位均有表达,灌浆期的表达量显著高于苗期和分蘖盛期(P<0.05),且受干旱、黑暗、高温和盐胁迫诱导高效表达.OsXDH过表达水稻转基因株系乳熟期剑叶的XDH活性和叶绿素含量高于野生型,OsXDH干扰转基因株系的XDH活性和叶绿素含量低于野生型.[结论]OsXDH基因受水稻生长发育和逆境胁迫因子诱导表达,推测其是调控水稻生长发育和响应逆境胁迫的关键基因.     

薏苡油脂合成关键基因克隆及其生物信息学分析

[目的]掌握薏苡二酰甘油酰基转移酶基因(ClDGAT)、内质网油酸脱饱和酶基因(ClFAD2)和硬脂酸脱饱和酶基因(ClSAD)的生物信息学特性,明确薏苡油脂代谢调控机制,为今后开展以提高薏苡含油量和改良脂肪酸组成为目标的育种研究提供理论依据.[方法]利用RT-PCR和RACE克隆薏苡油脂合成关键基因(ClDGAT、ClFAD2和ClSAD),通过染色体步移技术获得ClFAD2和ClSAD基因启动子序列,并以ExPASy ProtParam tool、SMART、TMHMM Server v.2.0和SOPMA等在线软件进行生物信息学分析.[结果]从薏苡叶片中成功克隆获得ClDGAT、ClFAD2和ClSAD基因,NCBI登录号分别为MK589802、MK589803和MK589804.其中,ClDGAT基因cDNA序列全长1842 bp,其开放阅读框(ORF)为1539 bp,编码512个氨基酸;ClFAD2基因cDNA序列全长1768 bp,其ORF为1164 bp,编码387个氨基酸,无内含子;ClSAD基因cDNA序列全长1727 bp,其ORF为1182 bp,编码393个氨基酸,有2个内含子.ClDGAT和ClFAD2为不稳定蛋白,ClSAD为稳定蛋白;ClDGAT为疏水性蛋白,ClFAD2和ClSAD为亲水性蛋白.ClDGAT蛋白含有MBOAT功能域,有9个跨膜区;ClFAD2蛋白含有2个功能域(DUF3473和FA_desaturase),有3个跨膜区;ClSAD蛋白含有FA_desaturase_2功能域,无跨膜区.基于蛋白氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,ClDGAT、ClFAD2和ClSAD均与高粱对应的蛋白聚类在同一分支上,即薏苡在进化关系上与高粱的亲缘关系最近.ClFAD2和ClSAD基因启动子序列上均含有光响应元件(Light responsive element)、生长素响应元件(Auxin-responsive element)、茉莉酸甲酯响应元件(MeJA-responsive element)和ABA响应元件(ABA responsive element).[结论]ClFAD2和ClSAD基因启动子序列上含有抗逆性相关顺式作用元件和植物激素响应元件,说明ClFAD2和ClSAD基因不仅参与薏苡的籽粒发育及油脂合成,还可能与植株的抗逆响应相关.     

水稻植酸酶基因OsPHY2启动子的克隆及生物信息学分析

水稻种子萌发后,新生器官分化和生长所需磷素主要来自于植酸酶对种子中贮存植酸及其盐类的降解.针对水稻植酸酶基因OsPHY2在萌发种子中优势表达、但其转录调控机制尚不明确的现状,本研究克隆了该基因的启动子.利用生物信息学工具对该启动子中含有的顺式调控元件分析表明,该启动子中除含有RNA聚合酶结合的重要保守元件TATA盒和调...     

银杏MECT基因启动子克隆及序列分析

以前期获得的银杏(Ginkgo biloba L.)MECT基因的c DNA序列为模板,通过设计特异性引物及采用染色体步移的方法从银杏基因组中克隆到Gb MECT翻译起始位点上游982 bp的启动子序列,研究银杏MECT基因启动子的结构及功能特点。生物信息学分析结果表明,该启动子序列中含有多种类型的顺式作用元件,主要有典型的光响应调节元件、激素响应调控元件、抗病虫害响应元件TGTCA序列、抗损伤应答元件ERF3和热激响应元件HSE等。此外,在该启动子片段中还含有氧胁迫和铜离子响应元件、淀粉酶响应元件等其他类型的作用元件,充分体现了启动子对基因表达调控具有转录水平上的高效性和复杂性的特点。