银杏GbERF1转录因子基因的克隆及亚细胞定位分析

ERF是植物中一类重要的转录因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的响应。以3年生银杏苗为试材,采用RT-PCR与RACE-PCR方法,研究了银杏ERF基因序列,以期深入了解银杏药用成分合成代谢的分子机理。结果表明:GbERF1含有长度为1 314bp的完整开放阅读框,编码437个氨基酸。蛋白序列分析显示,GbERF1蛋白含有2段ERF家族的特殊位点。GbERF1蛋白序列与北美云杉(ADE75663.1)序列的相似性为97%。系统进化树分析,GbERF1与北美云杉、狭叶羽扇豆的序列可划归为同一分支。实时荧光定量PCR结果显示,GbERF1主要在银杏根和叶中表达,逆境胁迫处理后显示,该基因在乙烯、紫外诱导处理下,表达量大幅度提升,随后下降,但仍高于对照组,干旱诱导处理下表达量先升高后降低,矮壮素(CCC)诱导下表达量变化不太明显。烟草叶片下表皮细胞亚细胞定位结果表明GbERF1定位于细胞核。     

板栗IFRs启动子分离及表达载体构建

以湖北省罗田板栗品种乌壳栗为试材,采用染色体步移的方法获得了板栗IFR启动子序列,研究了板栗黄酮代谢途径中关键基因IFR的启动子顺式作用原件及可能对雄花黄酮类物质合成的影响,并构建pCAMBIA1304融合载体。以期揭示板栗雄花黄酮代谢合成途径,IFRs启动子上游所包含的顺式元件对环境和栽培措施的响应及对板栗雄花发育的影响。结果表明:长度为1 688bp的板栗IFRs启动子序列包含多种类型的顺式作用元件,包括光响应元件GT-1motif、ASF-1motif等;与赤霉素,脱落酸、乙烯等相关的激素响应元件,如WRKY motif(赤霉素信号途径转录因子)、GCC-box(乙烯应答元件)以及Dc3(脱落酸响应元件)等;逆境胁迫相关的功能元件,如与抗损伤相关的ERF3、抗病相关的TGTCA-box等。以此推测,CmIFR基因的表达可能会受到以上光、激素、各种生物或者非生物胁迫等因素的影响。为了后期进一步研究启动子的功能,按照启动子功能区域,设计了CmIFR启动子不同长度的6个功能片段,并将这些片段替换pCAMBIA1304中的35S启动子,成功构建了由CmIFRPs启动子不同区域驱动的gus基因的植物表达载体pCAMBIA1304+CmIFRPs。     

银杏幼胚培养的多因子正交试验研究

以MS为基本培养基,选用银杏幼胚为试验材料,采用L9(34)正交设计分析比较2,4-D(A因素)、6-BA(B因素)、酸水解酪蛋白(CH,C因素)3个因素及其组合对银杏幼胚愈伤组织诱导率、褐化率及生长量的影响。结果表明:2,4-D 1.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+CH 500mg/L组合银杏的幼胚愈伤诱导率最高,为100%,同时该组合处理愈伤组织生长量也最大,增长倍数达8.11倍;而2,4-D 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L组合褐化率最高,为60.3%。经直观分析、方差分析和主因素效应的多重比较后认为,3个因素中,2,4-D对银杏幼胚愈伤诱导率及褐化率的影响最大,极差分别为74.196和63.702;CH对银杏幼胚愈伤生长量影响最大,极差为2.148。银杏愈伤组织诱导及生长的培养基最优组合为MS+2,4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+CH 500mg/L。     

银杏AP2/ERF转录因子鉴定及其ERF家族在逆境胁迫下的表达分析

AP2/ERF转录因子广泛参与银杏的生物学过程,其ERF基因家族存在着通过调控次生代谢来应对环境压力的可能。为探究ERF基因家族在这一过程中的应答机制,本研究分别构建了紫外和干旱处理下银杏叶转录组数据库,利用在线生物信息学工具对银杏AP2/ERF转录因子的保守结构域、理化性质及基因家族同源性进行分析,同时利用转录组测序技术检测了ERF基因家族在这两种逆境胁迫下的表达情况,筛选其中5个与类黄酮等代谢相关的ERF基因进行荧光定量PCR验证分析。结果表明,在银杏中共鉴定到61个AP2/ERF转录因子,根据其保守结构域特点分为4类,即ERF亚家族28个、DREB亚家族23个、AP2和RAV亚家族分别为5个。不同成员之间的氨基酸数目、等电点(pI)等理化性质有较大差别。从与拟南芥、大豆的序列同源性分析结果来看,同一个亚家族的成员之间亲缘关系较近。GbERF亚家族和GbDREB亚家族同属于银杏ERF基因家族,成员数最多。转录组预测分析结果显示,大部分ERF基因家族成员在紫外和干旱胁迫诱导下的基因表达量会增加。经验证,5个基因表达量的变化情况总体与预测结果一致。本实验结果为后期开展银杏ERF基因家族的功能研究提供科学依据。     

银杏两个WD40转录因子基因克隆及序列分析

WD40转录因子也称WDR(WD repeat)蛋白,是一种古老蛋白家族,参与调节类黄酮次生代谢途径中多种酶基因的表达,从而影响类黄酮的积累。以三年生银杏苗为试材,采用RT-PCR和RACE-PCR方法,研究了银杏WD40基因序列,以期深入了解银杏叶类黄酮合成代谢的分子机理。结果表明:GbWD401序列包含一段2 313bp的开放阅读框,编码一个770aa的肽链;GbWD402序列包含一段1 605bp的开放阅读框,编码一个534aa的肽链。银杏GbWD401和GbWD402基因推测编码蛋白序列均含有典型WD40重复基序。GbWD401蛋白序列与无油樟AtWD401相似性为49%,GbWD402蛋白序列与无油樟AtWD402相似性为78%。系统进化树发现,GbWD401与无油樟AtWD401、荷花NnWD40划归为同一分支;而GbWD402与无油樟AtWD402划归为另一分支。     

植物富硒栽培研究进展综述

从硒在自然界中的存在形态、硒与人体健康、硒对植物生长影响、硒对植物次生代谢的影响以及植物富硒栽培的常规技术等方面对植物富硒栽培的研究进行了论述,提出了在植物富硒栽培方面存在的问题,并展望了富硒栽培应用的发展趋势。     

罗田板栗种质资源ISSR分子标记初步鉴定

试验以湖北省罗田县的15个板栗主要栽培品种为材料,利用ISSR分子标记对15个板栗品种进行初步认证及亲缘关系分析.结果表明,从35条ISSR引物中筛选出17条能够扩增出清晰、稳定条带的引物;17条引物共扩增出392条带,其中多态性条带有344条,多态性条带比率为87.8％.应用NTSYS 2.10e软件进行UPGMA法聚类分析,15个板栗品种大致被分为三类.其中普通八月红和特殊八月红基本无遗传差异,玫瑰红与乌壳栗,六月暴和桂花香亲缘关系较近.初步鉴定结果可为板栗品种鉴别、分类及种质资源的有效利用提供理论依据.     

植物生长调节剂对豆腐柴愈伤组织诱导的影响

以湖北省罗田县野生豆腐柴叶片为材料,在MS培养基上附加不同浓度和比值的激素进行愈伤组织的诱导试验.结果表明:不同外源激素浓度及配比对外植体愈伤组织诱导率的表现不同,NAA比IBA更有利于豆腐柴愈伤组织的形成和生长;而低浓度6-BA更适于豆腐柴愈伤组织的分化与生长;外源激素的配比对愈伤组织诱导率有一定影响,浓度比为0.2的6-BA/NAA有利于豆腐柴愈伤的形成和生长;愈伤组织培养最终认为,诱导豆腐柴愈伤组织和生根的适宜培养基为0.2 mg/L 6-BA和1mg/L的NAA.     

银杏MECT基因启动子克隆及序列分析

以前期获得的银杏(Ginkgo biloba L.)MECT基因的c DNA序列为模板,通过设计特异性引物及采用染色体步移的方法从银杏基因组中克隆到Gb MECT翻译起始位点上游982 bp的启动子序列,研究银杏MECT基因启动子的结构及功能特点。生物信息学分析结果表明,该启动子序列中含有多种类型的顺式作用元件,主要有典型的光响应调节元件、激素响应调控元件、抗病虫害响应元件TGTCA序列、抗损伤应答元件ERF3和热激响应元件HSE等。此外,在该启动子片段中还含有氧胁迫和铜离子响应元件、淀粉酶响应元件等其他类型的作用元件,充分体现了启动子对基因表达调控具有转录水平上的高效性和复杂性的特点。     

银杏叶片中萜内酯的提取工艺

以银杏叶片为试材,采用乙醇-水浸提法,设计单因素试验,研究了乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度4个提取参数对萜内酯得率的影响,优化了提取工艺。结果表明:提取萜内酯的最佳工艺为料液比1∶150g·mL~(-1),提取温度60℃,60%乙醇,提取2.0h;最佳洗脱条件是石油醚∶乙酸乙酯=1∶2(v/v),一次性洗脱。经过HPLC-ELSD分析,该工艺提取率高,操作简便,具有可信度。