低温胁迫下佛手和枳乙烯应答因子6（ERF6）表达变化的比较分析

 以柑橘属寒敏感植物佛手‘青皮’品种叶片cDNA为模板,通过RT-PCR与RACE扩增,获得一个1 160 bp的乙烯应答因子（ethylene response factor,ERF）基因的cDNA序列,其基因编码区共999 bp,含有一个保守的AP2/EREBP结构域,与拟南芥AtERF6为同源基因,命名为CmsERF6（GenBank登录号为HQ698835）。4 ℃低温处理佛手和枳（柑橘属近缘种耐寒植物）植株,测定其寒胁迫生理指标（电解质渗出率、丙二醛含量）。使用实时荧光定量PCR,对佛手和枳叶中的ERF6表达含量进行测定分析,结果表明：低温对佛手与枳的ERF6表达均具有诱导作用,且表达量的变化趋势存在明显的差异。尤其在枳中,ERF6的表达较对照组上升约4 000倍,且电解质外渗率的变化与ERF6基因表达量变化具有一致性,说明ERF6基因参与低温胁迫应答。     

蝴蝶兰AP2/ERF家族基因的克隆及在低温下表达特性分析

用RT-PCR方法从‘大辣椒’蝴蝶兰叶片中克隆得到4个AP2/ERF家族基因，命名为PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4。蛋白结构域和序列比对发现PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4均含有1个AP2结构域， PhAP2/ERF2还含有1个B3结构域。进化树分析表明4个蛋白与兰科AP2/ERF家族成员亲缘关系最近，PhAP2/ERF1属于AP2/ERF家族DREB亚家族中的A1类，PhAP2/ERF2属于RAV亚家族，PhAP2/ERF3属于ERF亚家族的B4类，PhAP2/ERF4属于DREB亚家族中的A2类。用实时荧光定量PCR方法检测低温驯化和低温胁迫条件下PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4在‘大辣椒’和‘富乐夕阳’蝴蝶兰叶片中的表达特性，结果表明：4个基因在‘大辣椒’叶片中的表达趋势一致，表达量在低温胁迫早期达到最高，在胁迫中晚期有所下降；而4个基因在‘富乐夕阳’叶片中的表达趋势有较大差异，PhAP2/ERF1和PhAP2/ERF2的表达在低温处理整个过程中没有被诱导或仅有较小幅度增加，PhAP2/ERF3对低温的响应时间显著晚于‘大辣椒’，PhAP2/ERF4的表达趋势与‘大辣椒’差异较小。蝴蝶兰AP2/ERF在抗冷品种‘大辣椒’和不抗冷品种‘富乐夕阳’叶片中的表达差异暗示AP2/ERF基因家族在蝴蝶兰低温胁迫响应中起重要调控作用。     

柑橘CitERF9和CitAP2-7在不同逆境和外源激素处理下的表达

以‘资阳’香橙(Citrus junos‘Ziyang’)为试材,分别对Cit ERF9和Cit AP2-7进行了分析。结果表明:Cit ERF9基因的开放阅读框(ORF)为735 bp,含有1个外显子,可编码244个氨基酸残基的多肽。Cit AP2-7的开放阅读框为1 080 bp,具有6个外显子,可编码360个氨基酸残基。同源分析结果显示,这两个基因编码的蛋白与大豆、蓖麻、碧桃、苜蓿等植物中的同源蛋白有81%~84%的相似性。实时定量分析表明:Cit ERF9和Cit AP2-7在植株不同组织间的表达具有明显差异。在根中,Cit ERF9受各种胁迫处理诱导,而Cit AP2-7主要受ABA、Na Cl、脱水等的诱导。在叶中,各种胁迫均对Cit ERF9具有诱导作用,其模式与根中相似,而Cit AP2-7的表达则主要受ABA、ACC、Me JA、SA等激素以及低温和Na Cl的抑制。试验结果表明,Cit ERF9和Cit AP2-7参与了激素和非生物胁迫的响应过程。     

苹果MdDRB1的表达与功能分析

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为试材,扩增Md DRB1基因,分析其序列结构,同时原核诱导Md DRB1蛋白并观察其亚细胞定位。利用q RT-PCR检测Md DRB1在非生物胁迫下的表达量,通过遗传转化苹果苗鉴定Md DRB1在非生物胁迫中的功能。基因结构分析显示,Md DRB1具有2个内含子和3个外显子。亚细胞定位显示,Md DRB1主要定位于细胞核,少数定位在细胞质。原核诱导结果显示,Md DRB1融合蛋白以包涵体的形式存在。同时发现Md DRB1反义转基因愈伤中与抗性相关的mi RNA的表达水平上调。在PEG、ABA、盐和低温处理的材料中Md DRB1的表达水平明显上调。另外,Md DRB1过量表达明显提高了转基因苹果组培苗的抗性。推测Md DRB1在抗逆胁迫响应中有重要作用。     

银杏类黄酮3’羟化酶基因的克隆与表达分析

利用简并PCR和RACE技术从银杏叶片中分离到黄酮3’羟化酶基因Gb F3’H的c DNA全长序列(Gen Bank No.:KP056747)。其全长为2 144 bp,含有一个1 671 bp的开放式阅读框(ORF),编码556个氨基酸序列,预测氨基酸大小为63.47 k D,等电点为7.71。蛋白质同源序列分析表明,Gb F3’H与其他物种F3’H同源性较低,而与菊苣(Cichorium intybus)同源性最高,为56.3%。同源建模分析显示Gb F3’H与P450家族蛋白的三维结构及活性位点高度相似,最终定位于微粒体膜上。进化树分析结果显示Gb F3’H与其他植物分化较早,序列差异较大。组织表达分析显示,Gb F3’H在银杏不同组织中都有表达,其中雄蕊表达水平最高,其次为成熟叶。诱导表达分析显示,Gb F3’H转录水平受UV-B、6-BA、SA、ABA和IAA影响诱导上调,而伤害处理对其表达量无明显影响。Gb F3’H诱导表达模式与调控银杏黄酮含量变化呈正相关,其上游调控序列存在与黄酮调控相关的顺式元件,意味着Gb F3’H可能参与了银杏黄酮类物质的合成代谢,并与黄酮类物质向花青素合成分流有关。     

响应黄龙病侵染的柑橘乙醇脱氢酶基因CsADH1的克隆与表达分析

对前期在感染黄龙病的‘晚锦橙’中发现的明显差异表达的柑橘乙醇脱氢酶（CsADH1）基因进行克隆测序分析，结果表明，CsADH1 的 CDS 序列长为 1 143 bp，编码 380 个氨基酸。蛋白质结构预测显示，CsADH1 含有乙醇脱氢酶 GroES（ADH_N）和 ADH_zinc_N 保守结构域。进化树分析显示，CsADH1 蛋白与拟南芥、蓖麻和中国莲的 ADH 蛋白亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示，CsADH1 蛋白定位在细胞质中。以感病‘晚锦橙’的根和叶脉为材料，qPCR 分析显示 CsADH1 在感病根和叶脉中均上调表达，且根中的表达水平是叶脉中的 10 倍。离子胁迫试验和外源植物生长调节剂诱导试验表明，Zn、水杨酸（SA）、生长素（IAA）和脱落酸（ABA）均显著诱导 CsADH1 上调表达，并且根中的表达水平明显高于叶中。本结果表明，CsADH1 可能在柑橘根响应黄龙病菌侵染中起着重要作用。     

香蕉海藻糖-6-磷酸合成酶基因MaTPS2克隆及表达特性分析

在获得MaTPS2基因全长序列的基础上,采用同源序列比对、聚类分析、实时定量PCR等技术初步探讨香蕉MaTPS2基因的功能。从香蕉A基因组中获得一条3 277bp MaTPS2全长序列,包含一个完整的开放阅读框1 344bp,编码蛋白含447个氨基酸。其氨基酸理化性质分析表明,MaTPS2蛋白属于不稳定疏水性蛋白,具有一个结构域GT1-TPS。通过与已知植物的TPS氨基酸同源序列比对,同源性达77.95%。系统发育树进化关系分析表明,MaTPS2编码的氨基酸序列与银杏TPS氨基酸序列(AAX16014.1)邻近,说明二者的亲缘关系较近。器官特异性分析表明,MaTPS2在香蕉植株的根、球茎、假茎、叶、花各器官中均有表达,其中在球茎、假茎和叶中表达量较多,在果实中表达量较低。在ABA、干旱、盐害和枯萎病菌胁迫处理下,MaTPS2表达量升高,在ACC胁迫处理下,MaTPS2表达量显著下降,而低温胁迫条件下,MaTPS2表达不响应。由此推导,MaTPS2可能参与调控香蕉抗旱、抗病机制。植物生长调节剂ACC和ABA胁迫处理说明MaTPS2的表达可能受激素蛋白间接调控。     

扁桃AcCBF1转录因子的克隆及表达分析

【目的】分离和克隆新疆栽培扁桃CBF1转录因子基因,了解其在扁桃响应环境胁迫和逆境相关激素诱导的表达情况。【方法】以新疆扁桃幼苗为试验材料,对其进行低温、干旱、盐及ABA处理,使用PCR技术从新疆扁桃‘双果’克隆得到CBF1转录因子基因,通过农杆菌将35S-Ac CBF1-GFP融合质粒转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察结果,并通过实时荧光定量PCR技术分析了SG-Ac CBF1转录因子基因在不同非生物逆境胁迫下的表达情况。【结果】序列分析表明,该基因编码框为729 bp,编码242个氨基酸,蛋白质分子量为27.405 ku,命名为SG-Ac CBF1,GenBank登录号为KM245571。氨基酸序列同源比对分析证实,SG-Ac CBF1属于CBF转录因子家族基因。系统发育树分析表明,SG-Ac CBF1与甜樱桃Pa DREB1的亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示,SG-Ac CBF1蛋白定位于细胞核中。实时荧光定量PCR分析结果表明,低温、干旱、盐及ABA均能诱导SG-Ac CBF1基因表达。【结论】SG-Ac CBF1转录因子具有核定位功能,并参与了植物对逆境胁迫的调控。由于该转录因子属于家族基因,因此其对环境胁迫响应的强弱还有待探讨。     

茶树硫酸盐转运蛋白基因CsSULTR3.1的克隆及其对硫和硒的响应分析

从茶树(Camellia sinensis)根系中克隆获得1条长度为1 999 bp的核酸序列,该序列包含1 980 bp的开放阅读框(ORF),编码659个氨基酸。BlastX同源性比对显示,该基因编码的氨基酸序列与葡萄VvSULTR3.1相似度最高(86%),将其命名为CsSULTR3.1(GenBank登录号:KY963793)。进一步分析显示,该基因编码的蛋白分子量为72.39 kD,理论等电点为7.61,属于非分泌性蛋白,包含10个跨膜结构域。以GFP作为标记进行亚细胞定位发现,该蛋白定位于细胞质中。qRT-PCR分析显示,CsSULTR3.1具有组织表达特异性,在茶树茎中表达量最高。CsSULTR3.1在茶树根系中的表达受Na_2SO_4和Na_2SeO_4诱导:60 mg·L~(-1) Na_2SO_4处理12 h后逐渐上调表达,在48 h时达到最大值,而240 mg·L-1Na_2SO_4处理12 h内显著下调表达,随后显著上调并维持相对稳定状态;在不同浓度Na_2SeO_4处理条件下表达量均呈现先降低后升高再降低的趋势,且均在48 h时达到最高。     

香蕉抗逆相关基因MaERF的克隆与表达分析

 根据已获得的AP2/ERF基因片段,通过RACE方法获得一个香蕉ERF基因完整编码区序列,命名为MaERF。该基因cDNA全长1 611 bp,其中开放阅读框1 128 bp,编码376个氨基酸,包含一个保守的AP2/ERF结构域,基因组序列全长2 881 bp,含有一个内含子,剪切位点符合“GT-AG”规则;系统进化树表明该基因属于植物ERF转录因子家族的B2亚群。半定量RT-PCR分析表明,该基因在香蕉各个器官中均有表达,其中在根和叶中的表达量较低,而在果实和花中的表达较高;实时荧光定量Real-time PCR检测表明,受尖孢镰刀菌侵染及低温胁迫后,香蕉中该基因表达明显上调,推测其在香蕉胁迫反应中可能发挥重要作用。