棉花种子特异性启动子的克隆及序列分析

启动子是基因表达的重要顺式调控元件,在基因工程中,种子特异性启动子可以调控外源基因在种子中特异表达,提高表达效率,增强转基因的效果。本试验根据棉花LEA蛋白D34基因序列设计引物,以海岛棉基因组DNA为模板,通过touch down PCR技术,获得D34基因的种子特异性启动子片段。测序结果表明该片段长1 384 bp,与已发表的D34基因序列相似度为94.87%。该片段除了含有启动子的基本元件TATA框、CAAT框外,还含有种子特异性启动子元件E-box、G-box、B-box、AACA基序等。此外,对其顺式元件做了生物学功能分析。     

花生AhFAD2A基因启动子的克隆与序列分析

利用染色体步移技术,从花生品种鲁花14中克隆到716 bp的AhFAD2A基因启动子片段。序列分析表明,该启动子中含有多种种子特异性表达的元件,如GCN4基序、AGCCCA序列元件、Skn-1基序等,可能与AhFAD2A基因在种子中有较高的表达水平有关。启动子中预测的调控元件的功能还需进一步实验验证。     

甘蓝型油菜种子特异表达油体蛋白启动子P_(BnOA03)的克隆及功能分析

为了改良油菜种子的性状,常常需要研究种子特异表达目的基因的情况。在分析油菜油体蛋白表达模式的基础上,选择种子特异高表达的油体蛋白,根据甘蓝型油菜基因组序列设计引物,利用PCR技术从基因组中克隆到一段715bp的启动子序列。启动子顺式元件分析表明,这一克隆序列具有CAAT-box和TATA-box启动子基本元件,另外含有ABA响应元件等多种顺式元件。进一步利用GUS报告基因在拟南芥中对该启动子的功能进行鉴定,结果表明,在转基因株系的幼苗、根、茎、叶、花和种子发育前期及成熟种子中没有检测到GUS基因明显表达,在种子发育的中后期检测到GUS基因的表达逐渐增强。说明这个启动子的表达调控具有一定的种子特异性。     

麻疯树JcWRI1基因启动子克隆及功能分析

WRI1基因在控制从碳水化合物到脂类的转化过程中起着重要的作用。通过qRT-PCR方法分析了JcWRI1在麻疯树不同组织中的表达特性,结果表明:JcWRI1主要在种子中表达。同时克隆了麻疯树JcWRI1基因起始密码子上游2 000 bp序列。序列分析表明,该序列不仅包含有TATAbox和CAAT-box基本元件,而且含有胚乳表达所需的顺式调控元件、脱落酸应答相关顺式作用元件、光响应元件及各种胁迫响应元件。将该启动子与GUS报告基因连接构建表达载体,并转化水稻。GUS组织化学染色分析结果表明,JcWRI1启动子驱动GUS基因在根、茎、叶中有很低的表达,然而在种子中具有较高的表达活性。表明该启动子主要在种子中表达,并受多种因子的调控。     

甘蔗乙烯受体Sc-ERS启动子的克隆与序列分析

【目的】克隆甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列,分析Sc-ERS基因启动子序列的作用元件。【方法】采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术,从甘蔗ROC22基因组DNA中克隆Sc-ERS基因启动子序列,利用启动子预测软件PlantCARE和PLACE在线工具对Sc-ERS启动子序列的作用元件进行预测。【结果】克隆获得Sc-ERS启动子序列1410 bp, 该序列与玉米ERS25、ERS14核苷酸同源性分别为82%和80%。PlantCARE 在线分析结果表明,该序列具有启动子基本作用元件TATA-BOX和CAAT-BOX,还含有参与光响应元件、干旱诱导MYB 结合位点、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件、胚乳表达顺式调控元件、热胁迫响应元件等。【结论】从甘蔗基因组DNA中克隆获得乙烯受体Sc-ERS基因上游1410 bp的启动子序列,该序列含有多个特异性调控元件,推测Sc-ERS基因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。     

甘蔗乙烯受体Sc-ERS启动子的克隆与序列分析

【目的】克隆甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列,分析Sc-ERS基因启动子序列的作用元件。【方法】采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术,从甘蔗ROC22基因组DNA中克隆Sc-ERS基因启动子序列,利用启动子预测软件PlantCARE和PLACE在线工具对Se-ERS启动子序列的作用元件进行预测。【结果】克隆获得sc．ERS启动子序列1410bp,该序列与玉米ERS25、ERS14核苷酸同源性分别为82％和80％。PlantCARE在线分析结果表明,该序列具有启动子基本作用元件TATA．BOX和CAAT—BOX,还含有参与光响应元件、干旱诱导MYB结合位点、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件、胚乳表达顺式调控元件、热胁迫响应元件等。【结论】从甘蔗基因组DNA中克隆获得乙烯受体Sc-ERS基因上游1410bp的启动子序列,该序列含有多个特异性调控元件,推测sc．ERS;~因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

种子特异性启动子的研究进展

启动子是基因表达的重要顺式调控元件。对植物基因启动子的核心结构与功能、种子特异性启动子的结构特点、植物基因启动子克隆的方法、已经克隆的种子特异启动子及存在的问题进行了综述,并对该领域的发展趋势进行了展望。     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

银杏MECT基因启动子克隆及序列分析

以前期获得的银杏(Ginkgo biloba L.)MECT基因的c DNA序列为模板,通过设计特异性引物及采用染色体步移的方法从银杏基因组中克隆到Gb MECT翻译起始位点上游982 bp的启动子序列,研究银杏MECT基因启动子的结构及功能特点。生物信息学分析结果表明,该启动子序列中含有多种类型的顺式作用元件,主要有典型的光响应调节元件、激素响应调控元件、抗病虫害响应元件TGTCA序列、抗损伤应答元件ERF3和热激响应元件HSE等。此外,在该启动子片段中还含有氧胁迫和铜离子响应元件、淀粉酶响应元件等其他类型的作用元件,充分体现了启动子对基因表达调控具有转录水平上的高效性和复杂性的特点。     

转phyA2、ZmTMT和Bar玉米的获得及其特性分析

【目的】玉米是家禽和单胃动物饲料的主要原料,但玉米籽粒中高活性的α-生育酚含量较低,且籽粒中的磷主要是以植酸磷的形式存在,动物不能有效吸收利用,因此,饲料中需要添加化学合成的维生素E和无机磷或微生物来源的植酸酶以满足动物生长发育的需要,增加了饲料成本,同时又容易造成磷污染。通过转基因获得α-生育酚含量和植酸酶活性大量提高的玉米,为饲用玉米育种提供材料基础。【方法】构建含有3个基因表达盒的载体,采用农杆菌侵染的方法转化玉米,草铵膦作为筛选压力;通过喷施草铵膦和PCR鉴定的方法筛选转基因阳性植株,RT-PCR分析目的基因在转录水平的表达情况;Western blot分析目的基因在翻译水平上的表达情况,采用分光光度计测定转基因玉米籽粒中的植酸酶活性,利用HPLC测定籽粒中的维生素E含量,同时比较转基因株系与野生型在其他营养成分和农艺性状上的差异。【结果】构建了胚乳特异性启动子123387驱动的植酸酶基因phyA2表达盒、胚特异性启动子13387驱动的玉米γ-生育酚甲基转移酶基因ZmTMT表达盒以及组成型启动子CaMV 35S驱动的草铵膦抗性基因Bar表达盒串联的植物表达载体;转化玉米获得转基因植株;喷施草铵膦和PCR鉴定得到阳性植株;经过多个世代回交转育,获得目标性状均较好的2个转基因纯合玉米株系TPB1和TPB2;RT-PCR和Western blot分析结果表明phyA2、ZmTMT和Bar在转基因玉米中显著高表达。植酸酶活性测定结果表明,转基因玉米籽粒中植酸酶活性达到10 000—13 000 U·kg^-1。维生素E含量测定结果表明,转基因玉米籽粒中90%以上的γ-生育酚转化为α-生育酚,α-生育酚的含量达到50—70 mg·kg^-1,α-三烯生育酚的含量也有明显增加。转基因玉米中的植酸酶活性和α-生育酚含量完全能够满足动物饲料的需要。转基因株系的农艺性状与野生型无显著差异,TPB1的营养成分与野生型总体无显著差异,TPB2稍高于野生型但是未产生不利影响;且均具有草铵膦抗性。【结论】获得的富含维生素E和植酸酶、且具有除草剂抗性的玉米新材料可以用于玉米杂交种的开发应用,降低饲料成本,提高磷的利用率,减少环境污染。     

种子贮藏蛋白的基因启动子及其应用研究概述

在简述种子贮藏蛋白组成的基础上,对醇溶蛋白和谷蛋白等主要谷类种子贮藏蛋白的基因启动子研究进展进行了概述,特别是对调控种子贮藏蛋白基因种子特异性表达的重要顺式作用元件,如AACA基序、GCN4基序和醇溶蛋白框等的结构和功能给予了较详尽的介绍。同时,对种子贮藏蛋白基因启动子在生产目的基因产物、定向改良作物农艺性状等方面的应用进行了综述,并提出了存在的问题与展望。     

家蚕脑核蛋白抽提及其与PTTH基因启动子的凝胶阻滞分析

 【目的】转录调控对于明确昆虫许多生理过程如抗药性、抗病性、行为、进化及发育等方面的机理具有重要意义。家蚕PTTH是调控生长发育的重要神经肽,明确其转录调控机理对阐明其表达的发育和组织特异性具有重要价值。【方法】本文克隆并测定了家蚕PTTH启动子序列,利用Matinspector分析软件预测该片段可能包含的顺式作用元件,采用高糖抽提缓冲液抽提家蚕脑核蛋白;标记PTTH启动子片段进行凝胶阻滞分析。【结果】家蚕PTTH启动子分析含有MEF2、TATA box、pbx-1等元件;抽提获得理想的脑核蛋白,脑核蛋白可以与PTTH转录起始位点附件119bp的序列特异地结合,把TATA Box的TATATAA突变后,脑核蛋白与突变后的探针MBS2不能结合。【结论】表明本研究中抽提的脑核蛋白是有效的,首次检测家蚕PTTH启动子可以与转录因子特异结合,初步鉴定了TATA Box。     

海马齿SpSCL1基因启动子克隆及序列分析

GRAS蛋白是植物特有的一类蛋白家族,在植物的生长发育方面具有重要作用.根据前期分离的海马齿SpSCL1基因的5'端序列,设计特异引物进行Genome Walking,从海马齿基因组DNA中克隆了SpSCL1基因上游的1 254 bp片段.序列分析表明,该序列包含681 bp的启动子调控序列及573 bp的基因编码序列,启动子调控序中除含有典型的真核生物核心启动子区域(-60～-10bp)外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与脱水、耐盐和光响应相关的顺式作用元件.结果预示海马齿SpSCL1可能在抗旱、耐盐以及光敏色素信号转导途径中发挥重要作用.     

Improvement of organic phosphate acquisition in transgenic tobacco plants by overexpression of a soybean phytase gene Sphy1

Due to the huge amount in the soil, phytate is an important potential source for providing the plants with available phosphorus (Pi) by the involved catalytic reaction of phytase. In this study, a construct fusing the open reading frame (ORF) of Sphy1 into corresponding positions in the fragment of binary expression vector pBI121 was created and used to transform tobacco. Molecular identification by PCR and RT-PCR indicated the target gene Sphy1 in the transgenic tobacco plants was transcribed under the regulation of an upstream promoter. Compared with the control plants, the phytase activities in all the transgenic plants were increased, with the increased range consistent with the expression levels in the transgenic plants. Under the growth conditions with phytate as the sole phosphorus source, the transgenic line 1 plants displayed a high expression level of Sphy1 and shows notable improved growth performance, such as higher fresh weight and dry weight, as well as higher total P content and more accumulative P amount per plant than CK. This clearly indicated that overexpression of Sphy1 could improve the phosphorus acquisition by the extruded Sphy1 phytase in the rhizosphere, where this enzyme could catalyze the degradation of the phytate and release the available Pi for plants. The Sphy1 gene seemed to have a potential value in the creation of new crop cultivars with high phosphorus use efficiency.     

巴西橡胶树小橡胶粒子蛋白基因5''调控序列的克隆及功能初步鉴定

法尼基焦磷酸合酶是异戊二烯生物合成途径中的一个关键酶,根据NCBI数据库中巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因HbFPS序列设计引物,克隆了HbFPS起始密码子上游1066bp的5'调控序列。序列分析表明,该序列A/T含量为77.39%,含有典型的真核生物核心启动子区域,在该序列中发现了一些与真核生物典型的顺式调控元件相似的TATA-box、增强子元件、CAAT-box和GATA-box以及一些与激素、胁迫诱导、转录因子相关的顺式作用元件。构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,对获得的转基因烟草T0代植株GUS染色发现转基因植株呈现蓝色,表明HbFPS的5'调控序列可以驱动GUS基因的表达,具有启动子的活性。