不同牛种SOCS6基因5'调控区多态性分析

为筛选SOCS6基因启动子区域单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)并研究其对启动子功能元件的影响,选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建DNA池,直接测序筛选SNP位点.结果表明,SOCS6基因5'调控区存在4个SNP位点,分别为T-513G、C-401T、A-332G和T-180G.生物信息学软件预测得到SOCS6基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近部分转录因子结合位点消失和新位点产生.多态性位点对转录因子结合位点有显著影响,但并不改变CpG岛大小.     

牛SOCS5基因5'调控区多态性研究

[目的]筛选SOCS5基因启动子区多态位点(SNP),并研究其对启动子功能元件的影响.[方法]选择贵州地方优良品种务川黑牛和中国荷斯坦奶牛两种生长性能差异明显的品种构建DNA池,直接测序后用DNASTAR软件进行序列拼接和校正,BLAST分析SOCS5基因多态性,然后用生物信息学软件预测序列核心启动子区和CpG岛,分析SNP位点对转录因子结合位点影响.[结果]牛SOCS基因5调控区和第1外显子区存在3个SNP位点,分别为:C-577T、T-43C和C+61T,其中C+61T与SNP数据库中的rs110977810信息相符,C-577T和T-43C为新发现SNP位点.生物信息学软件预测得到SOCS5基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近大量转录因子结合位点消失和新位点产生;SNP位点对转录因子结合位点有显著影响,但对核心启动子范围和起始位点无明显影响,不在甲基化水平上影响SOCS5基因表达水平.[结论]牛SOCS5基因5'调控区存在3个对启动子功能元件有较大影响的SNP位点.     

牛SOCS5基因5′调控区多态性研究

【目的】筛选SOCS5基因启动子区多态位点（SNP）,并研究其对启动子功能元件的影响。【方法】选择贵州地方优良品种务川黑牛和中国荷斯坦奶牛两种生长性能差异明显的品种构建DNA池。直接测序后用DNASTAR软件进行序列拼接和校正,BLAST分析SOCS5基因多态性,然后用生物信息学软件预测序列核心启动子区和CpG岛,分析SNP位点对转录因子结合位点影响。【结果】牛SOC5基因5′调控区和第1外显子区存在3个SNP位点,分别为：C-577T、T-43C和C＋61T,其中C＋61T与SNP数据库中的rs110977810信息相符,C-577T和T-43C为新发现SNP位点。生物信息学软件预测得到SOCS5基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近大量转录因子结合位点消失和新位点产生;SNP位点对转录因子结合位点有显著影响,但对核心启动子范围和起始位点无明显影响,不在甲基化水平上影响SOCS基因表达水平。【结论】牛SOCS5基因5′调控区存在3个对启动子功能元件有较大影响的SNP位点。     

江口萝卜猪UCP2基因启动子变异分析

[目的]研究江口萝卜猪UCP2基因启动子变异,并对其进行生物信息学分析,为江口萝卜猪品种选育及开发利用提供理论依据.[方法]利用江口萝卜猪基因组DNA构建混合DNA池,PCR产物直接测序后采用DNASTAR等生物软件分析筛选出SNP位点,然后采用Neural Network Promoter Prediction、TFsitescan、WebGene等生物信息学分析软件预测单核苷酸突变前后的UCP2基因启动子核心区域、转录因子结合位点和CpG岛.[结果]在江口萝卜猪UCP2基因启动子上共筛选到3个SNPs位点,分别是G-84>A、G-161>C和T-366>A.利用生物信息学分析软件分析单核苷酸突变对UCP2基因启动子核心区域、转录因子结合位点及CpG岛的影响,结果发现,从江口萝卜猪UCP2基因启动子上筛选到的3个SNPs位点均不在预测到的启动子核心区域,但靠近转录起始点;3个SNPs位点也不在预测得到的CpG岛内,且不会影响UCP2基因启动子的甲基化水平;3个SNPs位点能在不同程度上导致转录因子结合位点消失或产生新的转录因子结合位点,其中G-161>C突变对转录因子结合位点的影响最大.[结论]从江口萝卜猪UCP2基因启动子上筛选到3个SNPs位点,分别为G-84>A、G-161>C和T-366>A,虽然这3个SNPs位点均不在启动子核心区域及CpG岛内,但不同程度造成转录因子结合位点消失或产生,其中G-161>C的影响最大,可能是调控UCP2基因表达的重要功能突变位点.     

鸡NLRC5启动子区转录调控序列的初步研究

为了探讨NLRC5启动子的潜在调控机制,将NLRC5基因启动子系列缺失片段插入到pGL3-basic载体,构建重组质粒,并转染DF1细胞系。通过双荧光素酶实验寻找核心调控区,然后用目标捕获测序检测27个鸡品种的NLRC5核心启动子区的SNPs,并利用TRANSFAC,JASPAR和Meth Primer预测该区域的转录因子结合位点和CpG岛。结果显示,NLRC5启动子有2个核心区域,分别是1—617和1448—2108。第一个核心区域内存在3个SNPs,其中SNP1影响转录因子Hic1的结合序列,但SNPs对CpG岛不产生影响,表明NLRC5基因的启动子区的调控可能受不同因素的影响,但SNPs并不在甲基化的水平上影响启动子的活性。     

鸡TGF-β2基因启动子区多态性分析

为了研究鸡TGF-β2基因启动子区的SNP及其对启动子功能元件的影响,采用PCR-SSCP方法对16个鸡种的TGF-β2启动子区的554~824 bp(即3号染色体的19 433 476~19 433 746 bp)进行基因分型,经测序,共检测到3个有效的SNPs位点,分别是679位点的C/G,699位点的G/A,774位点的T/C。其中大骨鸡和太湖鸡在3个位点均检测到SNP存在,AA鸡在3个位点都没有发现SNPs。分别利用生物信息学软件JASPAR和MethPrimer预测TGF-β2基因启动子区转录因子结合位点和CpG岛,发现SNP位点可改变转录因子结合位点且位于CpG岛上,表明TGF-β2启动子区SNPs可能通过不同方式影响基因表达调控。     

基于生物信息学的鸡PGC1-α基因5''调控区的序列结构分析

利用BLAST、Neural Network Promoter Prediction、ORF Finder、CpG Island Searcher和TF SEARCH等在线软件预测鸡的PGC1-α基因的5’调控区的启动子、开放阅读框、CpG岛及转录因子结合位点。结果显示,鸡与其他物种的PGC1-α核苷酸序列同源性很高,达84%以上;PGC1-α基因5’调控区序列上启动子可能位于1 900 bp处;评分在85分以上时,该区域具有221个潜在的转录因子结合位点;有12个潜在的转录因子结合位点评分在95分以上;最大ORF位于1 411～1 617位核苷酸,共编码69个氨基酸;CpG岛为200 bp区间(1 900～2 100 bp)。     

猪HIF-1α基因启动子区及编码区的生物信息学分析

利用生物信息学方法,对NCBI中公布的猪缺氧诱导因子HIF-1α基因的5'端上游2 000 bp长度的候选启动子区进行了核心启动子及转录结合位点的预测;同时对其所编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、信号肽、高级结构及进化关系进行了分析.结果显示:猪HIF-1α基因5'端上游存在潜在启动子区,存在CpG岛,存在多...     

秦川肉牛CGI-58基因SNP位点与肉质及其启动子活性的关系

【目的】探究秦川肉牛CGI-58基因5′-调控区中1个新单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)位点与肉品质的关联性,及其对该基因启动子活性的影响。【方法】选取18~24月龄的480头秦川肉牛为研究对象,测定其肌内脂肪含量、眼肌面积和背膘厚等肉品质性状指标。颈静脉采集试验牛血样,提取DNA样品,PCR扩增CGI-58基因5′-调控区,通过直接测序技术检测其单核苷酸多态性,并使用SAS(version 8.1)软件提供的一般线性模型(GLM)对单核苷酸多态位点与肉质性状进行关联分析。通过MatInspector和cMethPrimer软件分析CGI-58基因潜在的转录因子结合位点及其甲基化水平。构建含有SNP位点不同基因型的双荧光素酶报告载体,并转染小鼠3T3L-1、C2C12细胞系和牛前体脂肪细胞,测定其在3种细胞中的荧光素酶相对活性,并进行统计学分析。【结果】在秦川肉牛CGI-58基因5′-调控区发现1个新的SNP位点:g.14451079AC。g.14451079AC位点共有3种基因型:AA、CC和AC,其中AA基因型频率最高,A等位基因频率大于C等位基因频率,且AC基因型的启动子活性与眼肌面积显著高于其他基因型。g.14451079AC由A到C的突变发生在CGI-58启动子区域中一个预测的转录因子结合位点v-myb的第2个碱基A上,该突变导致启动子活性发生了显著变化,且该转录因子结合位点位于软件分析的CpG岛上。【结论】秦川肉牛CGI-58基因启动子区g.14451079AC位点的单核苷酸多态性与眼肌面积存在显著关联,且对该基因启动子活性有极显著影响。     

鸡TGF-β2基因启动子区多态性分析

为了研究鸡TGF-β2基因启动子区的SNP及其对启动子功能元件的影响,采用PCR-SSCP方法对16个鸡种的TGF-β2启动子区的554~824 bp(即3号染色体的19 433 476~19 433 746 bp)进行基因分型,经测序,共检测到3个有效的SNPs位点,分别是679位点的C/G,699位点的G/A,774位点的T/C。其中大骨鸡和太湖鸡在3个位点均检测到SNP存在,AA鸡在3个位点都没有发现SNPs。分别利用生物信息学软件JASPAR和Meth Primer预测TGF-β2基因启动子区转录因子结合位点和Cp G岛,发现SNP位点可改变转录因子结合位点且位于Cp G岛上,表明TGF-β2启动子区SNPs可能通过不同方式影响基因表达调控。     

胰腺癌细胞株Runx3基因启动子区CpG岛甲基化的检测

目的 探讨胰腺癌细胞株中Runx3基因启动子区CpG岛的甲基化水平.方法 应用甲基化特异性PCR方法检测Panc -1、BxPC-3、AsPC-1三种胰腺癌细胞株及正常胰腺组织RunX3基因启动子区CpG岛甲基化水平.结果 在Panc-1、BxPC-3、AsPC-1细胞株中Runx3基因启动子区CpG岛的甲基化引物均发...     

两个贵州山羊品种GHSR和GHRL基因遗传变异及其与生长性状的关联性

【目的】探讨GHSR和GHRL基因作为山羊体重体尺性状候选基因的可能性,寻找与山羊生长性状相关的分子遗传标记。【方法】以贵州白山羊和贵州黑山羊为研究素材,采用DNA混合池结合PCR产物直接测序及PCR-SSCP技术检测GHSR和GHRL基因的单核苷酸多态性,利用SPSS (18.0)软件GLM统计模型分析基因SNPs不同基因型及合并基因型与贵州山羊生长性状的关联性,同时采用在线软件对GHSR基因进行生物信息学分析。【结果】在GHSR基因外显子2和3′UTR分别检测到G200A同义突变和T628C位点,而在5′UTR区和外显子1则未发现多态性。设计一对特异性引物对G200A位点进行PCR-SSCP分析,表现为3种基因型,依次命名为GG、GA和AA。GG基因型为优势基因型,在贵州白山羊和贵州黑山羊母羊群体中等位基因G为优势等位基因,其等位基因频率分别为0.6731和0.5243。而在贵州黑山羊公羊群体中A则为优势等位基因,其频率为0.5122。多态信息含量均表现为中度多态(0.25＜PIC＜0.50)。在GHRL基因内含子2处发现1个G141A突变,外显子2和外显子4处分别检测到2个同义突变(T78C和C14T),设计一对特异性引物对C14T位点进行SSCP分析,显示为2种基因型CT和CC。在所有试验群体中,CC基因型为优势基因型,其频率分别为0.7692、0.9417和0.9390,等位基因C为优势等位基因,其频率依次为0.8846、0.9709和0.9695,多态信息含量均显示为低度多态(PIC＜0.25)。χ²检验显示所有试验群体G200A和C14T位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。关联分析表明,GHSR基因G200A位点与山羊体重、体高、体斜长和管围显著相关 (P＜0.05),纯合子GG基因型优势较为明显,贵州白山羊GG基因型个体的体高显著高于GA基因型个体和管围显著高于AA基因型个体(P＜0.05)。C14T位点贵州黑山羊 (公羊) CC基因型个体的体重、体高和胸围显著高于CT基因型 (P＜0.05)。组合基因型对体高和胸围指标的影响显著(P＜0.05),表现为CCGG合并基因型个体的体高显著高于CCAA合并基因型个体 (P＜0.05)。生物信息学分析揭露,GHSR基因5’UTR处未检测到核心启动子区和CpG岛,仅发现1个CAAT-box和部分潜在的转录因子结合位点,G200A导致mRNA二级结构发生明显变化。GHSR蛋白二级结构以α-螺旋为主 (48.90%),三级结构及跨膜螺旋结构预测表明该蛋白是膜蛋白。【结论】研究初步推测GHSR基因和GHRL基因多态性及合并基因型对山羊生长性状具有较显著的影响,G200A和C14T位点可作为山羊生长性状的有效遗传标记用于指导山羊的分子育种。     

贵州白山羊和黔北麻羊TFAM 基因部分外显子多态性研究

利用黔北麻羊和贵州白山羊构建品种DNA池,设计1对引物分别扩增其TFAM基因第2外显子及第1内含子部分序列.PCR产物纯化后进行双向测序,DNAStar和BLAST分析确定多态性位点.利用生物信息学软件分析SNPs位点对TFAM基因RNA二级结构和TFAM蛋白二级、三级结构的影响.结果表明:在羊TFAM基因中筛选到5个SNPs:T 1005C、G1099C、A1130C、G1164C、T1287C,其中T1005C为同义突变,G1099C为错义突变,导致编码的甘氨酸(Gly)变为半胱氨酸(Cys);A1130C、G1164C、T1287C 3个突变位点均位于内含子区.SNPs位点对TFAM基因RNA二级结构和TFAM蛋白结构有一定影响.     

山羊GHRL 基因多态性及其与 体重、体尺性状的关系研究

采用PCR-SSCP 技术对贵州黑山羊和贵州白山羊GHRL 基因进行单核苷酸多态性检测,并分析其多态与体重、体尺性状间的关联性。结果发现,在GHRL 基因外显子4 处存在1 个同义突变位点（C345T）,表现为2 种基因型,分别命名为CC 和CT。基因型与体重、体尺性状关联分析结果显示,在贵州黑山羊（麦坪）群体中,CT 基因型个体的体重、体高和胸围均显著高于CC 基因型个体,而在贵州黑山羊（纳雍）和贵州白山羊群体中差异不显著。研究结果揭示,GHRL 基因突变位点（C345T）影响贵州黑山羊生长性状可能性较大,该位点有望作为山羊生长性状的一个标记辅助选择位点。     

猪 MKRN3 基因启动子区CpG岛在胚胎心脏组织甲基化模式分析

以梅山猪-大白猪正反交为模型,以65日龄和100日龄的胚胎心脏组织为研究材料,对MKRN3基因启动子区CpG岛进行预测,根据预测的CpG岛设计引物,采用重亚硫酸盐测序法(BSP法),分析MKRN3基因启动子区CpG岛在胚胎心脏组织的甲基化程度。结果显示:对于65日龄胚胎,猪MKRN3基因启动子区CpG岛在大白×梅山和梅山×大白杂交后代的胚胎心脏组织中均表现高度甲基化(75.6%、76.4%);对于100日龄的胚胎,大白×梅山杂交后代的胚胎心脏组织表现高度甲基化(80%),而梅山×大白杂交后代的胚胎心脏组织呈现低甲基化(35.6%)。由此可见,猪MKRN3基因启动子区CpG岛的甲基化模式随着正反交、胚胎发育时期不同而呈现出一定变化,即在胚胎发育65日龄时,正反交子代均具有高度甲基化;而在胚胎发育至100日龄,正交子代呈现高度甲基化,反交子代呈现低甲基化,说明在胚胎发育晚期父本或母本等位基因可能会发生明显的去甲基化。     

鸭MyoG基因启动子的生物信息学分析及其甲基化频率对基因表达的影响

采用RT–PCR技术扩增和克隆鸭Myo G基因启动子,并对其启动子序列进行生物信息学分析,采用Sequenom Mass Array技术检测Cp G岛在鸭肌肉组织中的甲基化水平,用q RT–PCR检测Myo G基因的表达量。结果表明,扩增得到鸭Myo G基因启动子序列2 730 bp,对启动子序列预测后,发现存在2个Cp G岛,其中Cp G岛(–2 536~–1 997 bp)存在5个转录因子结合位点和多个真核生物结构元件。甲基化检测结果表明:在鸭的个体和组织水平上,启动子甲基化率均未聚类在一起;Cp G位点甲基化频率存在个体差异,22%Cp G位点的甲基化频率与Myo G的m RNA表达量呈负相关(P0.05),78%Cp G位点的甲基化频率呈正相关(P0.05),其中,腿肌甲基化位点Cp G_1、Cp G_26.27.28.29的甲基化频率与Myo G基因表达水平均呈显著相关(P0.05)。Myo G基因在鸭与在哺乳动物中的转录调控机制存在差异。试验中发现多个影响鸭Myo G基因转录的潜在甲基化位点,其中Cp G_1与Cp G_26.27.28.29能通过DNA甲基化修饰影响Myo G基因在鸭腿肌中的转录。本研究结果可为鸭Myo G基因转录调控提供参考依据。     

哺乳动物BMP4基因A型启动子的比较分析

以鸭嘴兽BMP4基因组序列为模型,采用比较基因组学方法分析哺乳动物BMP4基因A型启动子的结构特点。该研究分离出一段长112bp的进化上高度保守的核心启动子序列以及多个转录因子结合位点和CpG岛结构,并且在BMP4核心启动子区域发现了2种具有重要生物学功能的回文结构,为进一步研究该型启动子的转录调控功能提供了理论基础。同时以鸭嘴兽基因组为参照模型,也为今后研究其他哺乳动物进化上保留下来的基因提供更多新信息。     

小鼠胞内氯离子通道5基因启动子核心功能区域鉴定及转录调控分析

为研究胞内氯离子通道5基因(Chloride intracellular channel 5,CLIC5)广泛参与调节细胞内的各项生理活动与生化反应,并探讨该基因自身的表达调控机制,以小鼠基因组序列为模板,利用PCR技术扩增小鼠CLIC5基因5′上游调控序列,将其插入荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中,同时采用5′侧翼区缺失的方法构建了7个缺失不同DNA片段的荧光素酶表达载体。重组质粒与海肾荧光素酶载体(phRL-TK)共同瞬时转染HEK-293细胞,经双荧光素酶报告基因活性分析后,确定CLIC5基因的核心启动子区。利用生物信息学方法预测其中转录因子结合位点及启动子区甲基化状况。结果表明,CLIC5基因启动子缺乏TATA盒,但含有典型的GC盒及其他潜在转录因子结合位点;双荧光素酶报告基因活性分析表明,CLIC5基因-329～+1、-624～+1、-917～+1和-2 230～+1区域的启动子活性较高,其中-624～+1区域的启动子活性最强。进一步分析表明,启动子区-624～-329存在负性调控元件,预测存在转录因子结合位点RXR heterodimer binding sites与GC-Box factorsSp1/GC,-420～-283范围内存在CpG岛位点。