猪圆环病毒2型·猪繁殖与呼吸综合症病毒混合感染及继发猪链球菌2型感染的诊断与控制

[目的]为养猪生产中猪病的防治提供依据。[方法]通过临床检查、PCR和RT—PCR检测,对猪场外购生长猪、自繁母猪及哺乳仔猪先后发生猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合症病毒混合感染的疑似病例进行分析。[结果]确诊为猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合症病毒混合感染,继发猪链球菌2型感染。通过采取隔离、淘汰、消毒、药物防治等综合措施,疫情得到有效控制。[结论]该研究可为类似猪病的控制提供借鉴。     

双黄连水煎液对猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外作用效果研究

[目的]通过建立的荧光定量PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒载量的检测,探究双黄连水煎液在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响.[方法]建立非洲绿猴胚胎肾细胞与猪繁殖与呼吸综合征病毒共感染模型,并应用CCK8法筛选双黄连水煎液的最大安全质量浓度.根据DNA序列数据库公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒-N蛋白参考序列,设计特异性引物,构建猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因质粒,建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的荧光定量PCR方法,研究最大安全质量浓度下的双黄连水煎液对猪繁殖与呼吸综合征病毒载量的影响.[结果]双黄连水煎液对非洲绿猴胚胎肾细胞的最大安全质量浓度为6.25 mg/mL,在此安全质量浓度下对猪繁殖与呼吸综合征病毒具有良好的阻断吸附和抑制复制作用,作用效果呈时间和剂量依赖性,而对猪繁殖与呼吸综合征病毒的直接杀灭作用效果不显著.[结论]成功建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒载量的荧光定量PCR方法,通过此方法检测到双黄连水煎液在6.25 mg/mL时具有抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用.     

猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白的纯化与免疫活性分析

[目的]对猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）的GPS蛋白进行纯化与免疫活性分析,为建立相应的血清学诊断方法奠定基础。[方法]用构建好的重组表达质粒pGEX-6P-5转化B121后经IPTG诱导表达。对表达产物进行可溶性分析,再将重组目的蛋白纯化后进行SDS—PAGE鉴定和Western—blot分析,最后用重组抗原进行豚鼠免疫试验。[结果]经层析扫描分析目的蛋白含量占菌体蛋白总量30％左右,纯化后目的蛋白纯度可迭80％。经Western—blot及豚鼠免疫试验对纯化蛋白进行分析后证明,表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。[结论]该研究为深入研究PRRSVORFs基因及其编码蛋白功能提供了材料,同时也为生产猪繁殖与呼吸综合症病毒基因工程产品奠定了良好基础。     

MS2噬菌体介导展示猪繁殖与呼吸综合征病毒线性表位的嵌合纳米颗粒制备及免疫原性

【目的】以MS2噬菌体外壳蛋白为载体,构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白上线性表位的嵌合纳米颗粒,并研究其免疫原性,为猪繁殖与呼吸综合征病毒或其他病毒表位展示提供新的方法和思路。【方法】利用重叠延伸PCR将GP5上优势线性表位基因序列插入到MS2噬菌体外壳蛋白基因上,构建重组载体,通过原核表达系统表达嵌合蛋白,目的蛋白经过硫酸铵沉淀和凝胶过滤层析纯化,用动态光散射和电镜对嵌合蛋白进行物理表征,通过蛋白印迹和动物免疫试验研究表位嵌合颗粒的免疫原性。【结果】成功将线性表位基因插入MS2噬菌体外壳蛋白基因,嵌合蛋白在原核表达系统中以水溶性表达,目的蛋白经过纯化,纯度达85%以上。嵌合蛋白在体外自组装形成了均一的、直径为25～31 nm的嵌合表位纳米颗粒,该嵌合颗粒免疫动物后,产生可以和灭活病毒反应的高水平抗体,具有良好的免疫原性。【结论】MS2噬菌体外壳蛋白可以耐受9个外源多肽(猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5上线性表位)的插入,在体外自组装形成嵌合病毒样颗粒。该颗粒将外源多肽高密度展示在表面,免疫动物可产生针对该表位的抗体。该技术可为猪繁殖与呼吸综合征病毒其他表位或更长串联表位的展示奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合症病毒结构蛋白GP5-M腺病毒载体的构建及其在山羊乳腺中的表达

猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)是严重威胁养猪业的病毒性疾病,疫苗免疫是预防该病的最有效途径,PRRSV糖蛋白GP5和基质蛋白M融合后制成的基因工程疫苗能够有效激发机体产生免疫应答。通过在GP5和M基因的5′端依次加上组氨酸标签序列、信号肽序列,利用Linker(GP)序列将GP5和M基因连接构建融合表达GP5和M蛋白的重组质粒pMD18T-SignalP-His-GP5-M。以该质粒为模板,构建重组腺病毒载体并包装腺病毒。结果表明,用包装的腺病毒感染乳腺上皮细胞,测得最佳感染复数(MOI)为25,定量PCR和Western blot方法均检测到GP5-M的表达。大量扩增腺病毒并使用不连续氯化铯浓度梯度离心纯化病毒,使用纯化的病毒灌注山羊乳腺,采用Western blot在收集的乳汁中也检测到GP5-M蛋白的表达。结果证实,利用腺病毒载体作为基因转导的媒介,在山羊乳腺中可以表达GP5-M融合蛋白。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2株ORF7基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]对猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2毒株核蛋白编码基因ORF7进行研究,为进一步了解其编码蛋白的功能和研制新的血清学诊断方法奠定基础。[方法]采用RT—PCR方法扩增HBKM2株的DR胛基因,然后利用DNAStar软件包对克隆的序列进行序列分析,将ORF7基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX—KG上,构建重组表达质粒pKG—N。将重组质粒转化到大肠杆菌B121。并经IPTG诱导表达,最后利用Western-blot对表达蛋白的免疫反应活性进行鉴定。[结果]HBKM2毒株的0R刀基因长约372bp;序列分析表明与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的同源性达99％以上;SDS—PAGE表明克隆的0R几基因在大肠杆菌中获得了高效融合表达：Western-blot分析表明,重组蛋白GST—N能够与PRRSV高免猪血清发生特异性的免疫反应。[结论]成功地扩增了ORF7基因。且GST-N融合蛋白能在大肠杆菌中高效表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因并在原核表达系统中表达。[方法]根据GenBank上登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸序列设计1对引物,用RT—PCR方法扩增出PRRSV的核衣壳蛋白（N）基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T．1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-N。将重组质粒转化大肠杆菌BL31（DE3）感受态细胞,经TPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测。[结果]PRRSV肺组织所提取的RNA,经RT—PCR扩增,得到一段392bp的片段,与预期结果一致。SDS—PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约39．866Da,与预期结果相同。重组菌体超声裂解后,经10％的SDS—PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为可溶性蛋白。     

猪蓝耳病病毒检测技术研究进展

猪蓝耳病俗称猪繁殖与呼吸综合症．是由猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）引起的一种严重的病毒性传染病。本文就近年来对该病毒的检测技术，包括病毒分离、聚合酶链式反应、逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）等的研究进展做了阐述。     

猪繁殖与呼吸综合症免疫学研究

猪繁殖与呼吸综合症是由猪繁殖与呼吸综合症病毒引起的高度传染性病毒病。笔者就呼吸综合症病毒的理化特性、生物学特征、基因组构成、病毒复制、免疫学特征以及疫苗等作一简述     

Establishment of A RT -PCR Method for Diagnosis of Porcine Reoroductive and Respiratory Syndrome

为建立一种方便快捷的检测猪繁殖与呼吸综合征的RT - PCR方法,根据GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因设计一对引物,并以合成的cDNA为模板,初步建立了检测猪繁殖与呼吸综合征的RT - PCR方法,进而对对照病毒及采集的病料组织进行了特异性、敏感性和重复性检测.结果显示,该研究建立的RT - PCR方法敏感性高,最低检测阈为10 TCID50/mL,扩增产物的特异性良好,重复性良好,可用于猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断及流行病学调查.     

猪繁殖与呼吸综合症的预防与控制

针对猪繁殖与呼吸综合症的传播、流行特点和危害,着重论述了猪繁殖与呼吸综合症防治措施和关键点,从而能消除和减少猪繁殖与呼吸综合症病毒的传播途径。     

PRRSV结构蛋白GP5的原核表达与鉴定

利用大肠杆菌原核表达系统体外表达猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒的GP5蛋白,可为GP5蛋白的应用奠定物质基础。研究利用PCR技术获得带有酶切位点的gp5基因,通过酶切、连接构建p Cold I-gp5重组质粒,并将其转化至BL21感受态细胞,获得阳性单克隆后诱导其表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western Blotting分析。结果显示,p Cold I-gp5原核表达载体构建成功,该重组载体在大肠杆菌表达系统中能够表达,并且重组蛋白GP5以可溶性蛋白的形式表达。     

猪繁殖与呼吸障碍综合症的综合防治技术

1猪繁殖与呼吸障碍综合症病原学特征 繁殖与呼吸障碍综合症是由猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒引起的一种高度传染性疾病,该病毒为单股正链RNA病毒,病毒粒子呈球形和卵圆形。该病毒对6～8周龄仔猪的肺泡巨噬细胞最敏感,引起细胞的圆缩、聚集脱落和迅速崩解,造成猪免疫力下降。该病毒抗原性差异很大,能产生快速变异,并且同型病毒毒株之间的重组概率也较高,并且很容易发生变异。     

一例仔猪蓝耳病检测报告

近年来,随着养猪规模的增加,猪病的发生日趋严重和复杂.广西某养猪场送来一急性死亡猪病料,通过发病情况、病理变化、细菌分离、PCR方法进行鉴定诊断,发病情况较为严重;剖检发现肺脏、淋巴结和脾脏肿大,但未从肺脏、脾脏和淋巴结分离出细菌.PCR/RT-PCR的结果显示,伪狂犬病毒为阴性,而猪繁殖与呼吸综合症病毒为阳性.确诊该病例为猪繁殖与呼吸综合症病毒感染.     

表达PRRSV NADC30-like毒株GP5-M的重组伪狂犬病病毒的构建及其生物学特性探究

为获得一株能够融合表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)GP5-M蛋白的重组伪狂犬病病毒PRV-GP5-M毒株，以猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)变异株TK基因缺失株PRV FJ01/TK-为病毒载体，以gI/gE基因为插入靶点，利用同源重组技术和CRISPR/Cas9技术敲除gI/gE基因，并在gI/gE位置上插入CMV-GP5-M表达盒，经噬斑纯化，成功构建能够正确表达GP5-M蛋白重组病毒PRV-GP5-M。进一步对该毒株的稳定性、生长动力学、培养特性、安全性等生物学特性进行探究。结果表明，该重组毒株具有良好的遗传稳定性、安全性，易于增殖培养。研究结果为靶向PRRSV GP5与M蛋白生成新的PRRSV疫苗提供了新的线索，同时可为预防近些年流行的PRRSV NADC30-like毒株和PRV变异株的疫苗研发提供重要参考。     

猪繁殖与呼吸综合征病原检测

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M、N基因、伪狂犬病毒和圆环病毒基因序列设计引物,分别应用RT-PCR和PCR方法对上海金山区某养殖猪场疑似为PRRS的送检样品进行检测,结果证实为PRRSV和圆环病毒混合感染。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NJ-a株ORF6基因的表达及特异性抗体的制备

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)VR2332 株的核酸序列设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV NJ-a株ORF6基因,将其连接入pMD18-T载体,经测序后克隆入原核表达载体pET-32a( )上,构建原核表达载体pET-ORF6.阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经异醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,PRRSV ORF6基因获得表达.以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔3次,获得抗PRRSV NJ-a株M蛋白的特异抗体.经Western-blotting证明,该多克隆抗体既能与原核表达的重组M蛋白发生反应,又能与PRRSV发生特异性反应;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与表达PRRSV M蛋白的293T细胞及感染PRRSV的Marc-145细胞发生反应.兔抗PRRSV NJ-a株M蛋白特异性抗体的获得,为进一步研究PRRSV M蛋白的表达和功能奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合症的防治措施

猪繁殖与呼吸综合症是由猪繁殖与呼吸综合症病毒引起的一种二类传染病.目前,该病对猪群的危害已不再单一,患病猪群开始出现一些继发感染,特别是由猪繁殖与呼吸综合症病毒变异株引起的一种急性高致死性疾病,俗称"猪蓝耳病",更让人们担忧.     

变异猪流行性腹泻病毒M和N双基因融合真核表达及其活性鉴定

[目的]体外表达变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M-N双基因融合蛋白并明确其生物活性,为开展PEDV新型疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白.[方法]将变异PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2(pM2)真核表达载体构建pM2-M真核质粒,通过同源重组将N基因克隆至M2-M基因片段构建pM2-M-N双基因融合重组质粒,然后转染293T细胞表达出M-N双基因融合蛋白.通过Western blotting、ELISA及免疫BLAB/c小鼠试验鉴定表达融合蛋白的生物学活性.[结果]扩增获得的M基因、N基因片段大小分别为678和1359 bp,且与原序列的相似性均达100.0%.将M基因和N基因并连接至pM2真核表达载体成功构建获得pM2-M-N双基因融合重组质粒,M-N双基因片段大小为2004 bp,且与原序列的相似性为99.3%.以pM2-M-N双基因融合重组质粒转染239T细胞,表达出大小约75 kD且具有免疫活性的M-N双基因融合蛋白,纯化的M-N双基因融合蛋白能与PEDV阳性血清反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒均无交叉反应;以其免疫BLAB/c小鼠能诱导产生特异性抗体.[结论]通过pM2真核表达载体能构建获得变异PEDV毒株的pM2-M-N融合双基因重组质粒,转染293T细胞后可表达出具有良好免疫活性的M-N双基因融合蛋白,为后期开展变异PEDV基因工程疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR鉴别诊断方法

为了快速鉴别诊断高致病性猪繁殖与呼吸综合症,参照GeneBank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Nsp2基因,设计了1对引物,建立了一种RT-PCR检测方法.该方法可以区分高致病性PRRSV毒株与经典PRRSV弱毒疫苗株,扩增PCV2、PRV、PPV和CSFV等均为阴性.该方法敏感性较高,可以检测到0.2 ng的病毒核酸.