气肿疽梭菌胶体金诊断试纸条的研制

为建立快速、准确、简便的检测气肿疽的胶体金免疫层析试纸条,以免疫层析法为指导,根据抗原-抗体的特性,建立了不需要再加入任何检测试剂且快速简便的检测方法。结果表明,胶体金与该单抗的最佳结合量为30μg/m L,最佳pH值为8.4,最佳NC膜为Millipore HFB1350220型。将纯化的气肿疽梭菌多抗及羊抗鼠IgG分别以1∶4和1∶8的稀释倍数喷于硝酸纤维素膜的T线和C线。对胶体金诊断试纸条进行验证,敏感度高,可检测到的最低抗原量为1×10~5CFU/m L,特异性强、无假阳性与交叉反应现象、有较好的稳定性。本研究旨在建立快速、准确、简便的检测气肿疽的胶体金免疫层析试纸条。     

延边黄牛气肿疽间接ELISA诊断方法的建立

[目的]检测延边黄牛气肿疽病原体,为牛气肿疽的检测提供科学方法和依据。[方法]采用气肿疽梭菌裂解菌体为抗原,建立检测该病原菌的酶联免疫吸附检测方法,确定其最适工作条件。[结果]气肿疽梭菌菌体裂解抗原最适包被浓度为50μg/m l;待检血清的最适稀释度为1∶200,酶标二抗的最适工作浓度为1∶2 000;对随机采集于延边地区的30份牛血清样品进行间接ELISA检测,阳性率为20%。[结论]建立的间接ELISA方法特异性和重复性好。     

温氏附红细胞体双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用辛酸硫酸铵法从温氏附红细胞体高免血清中提取IgG,过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶,建立了检测温氏附红细胞体抗原的双抗体夹心ELISA.结果显示:抗体最佳包被量为156μg/mL,酶标抗体最适工作浓度为1∶400,抗原最低检出量为6.64μg/mL,抗原及酶标抗体的最佳作用时间分别为1 h.应用建立的检测方法对河北省内222份奶牛血样进行了检测,阳性检出率为91.0%.证实:该方法灵敏度高,简便快速,适合作群体检测.     

检测猪肺炎支原体抗体间接ELISA方法的建立

选用猪肺炎支原体Mhp J株培养物制备抗原,建立检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA(酶联免疫吸附)方法.结果显示,ELISA试验的最佳反应条件为:抗原包被浓度为1.5 μg/ml,待检血清的最佳稀释浓度1∶100,2%明胶作封闭液,抗原抗体最佳结合时间为90 min,酶标抗体1∶10 000(体积比)稀释,最佳作用时间为60 min.对136份样品检测结果表明,建立的猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法与美国IDEXX公司生产的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒检测的符合率达到83.8%,假阴性率8.8%,假阳性率1.5%.     

间接ELISA法检测促卵泡素抗体方法的建立

建立了检测促卵泡素(FSH)抗体的间接ELISA方法,用该法检测由FSH-BSA免疫BaLb/c小鼠所分离的5份待检血清,结果均为阳性。通过反复试验,确立间接ELISA检测FSH抗体的最佳反应条件,即酶标二抗工作浓度为1∶1 200,抗原包被浓度10μg/mL,待测血清最佳稀释度为1∶500,封闭液为1.0%的脱脂奶粉,同时设置抗原阻断试验对结果进行验证。     

黄曲霉毒素M1检测ELISA条件的优化及应用研究

采用黄曲霉毒素M1与牛血清白蛋白偶联物抗原免疫Balb/C小鼠获得特异性抗体。利用此抗体,进行间接竞争ELISA法试验,确定了最佳抗原包被反应浓度为1.0μg·mL^-1,最佳抗原包被条件为4℃过夜,一抗和酶标二抗IgG-HRP最佳工作浓度为1∶8000和1∶5000。建立间接竞争定量ELISA方法,该方法的最低检出限是0.08ng·mL^-1,间接竞争ELISA50%抑制率浓度为0.62ng·mL^-1,校正曲线的线性范围为0.04～5ng·mL^-1。在此优化条件下制备的抗体检测黄曲霉毒素M1具有很高的特异性和灵敏性,具有实际应用价值。     

检测兔出血症病毒抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测兔出血症病毒(RHDV)抗体的间接ELISA方法,应用杆状病毒表达系统表达的RHDV VP60包被酶标板,经间接ELISA的最佳反应条件优化试验确定:抗原的包被浓度为4.62μg/ml,标准阴、阳性血清稀释度为1∶200,封闭液选用2%明胶;羊抗兔IgG最佳稀释度为1∶4 000。阻断试验、特异性试验、敏感性试验、重复性试验结果显示,该方法具有较高的特异性、敏感性和重复性。用建立的ELISA方法与血凝抑制试验对临床血清样品进行检测,结果显示,ELISA与HI检测兔血清的RHDV抗体阳性率分别为84.7%(955/1 127)和76.0%(857/1 127),符合率为91.3%。该方法的建立为检测RHDV抗体提供了一种安全、特异、敏感、快速、操作简便经济的检测方法,为兔出血症免疫监测和预防控制提供了科学的技术手段。     

应用间接竞争ELISA检测山羊痘抗体方法的建立

[目的]为山羊痘疫苗接种山羊后产生的抗体效价检测和山羊痘的诊断奠定基础。[方法]采用Vero-E6传代细胞分离山羊痘病毒抗原,建立检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA方法。[结果]检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA的最佳工作条件：最佳抗原包被浓度为1μg/ml,兔抗高免血清最佳稀释度为1∶16 000,待检血清的工作浓度为1∶400,阳性血清的临界值为45.19%,阴性血清的临界值为38.89%。用该试验建立的ELISA方法检测3 000份接种山羊痘疫苗的山羊血清,阳性检出率为83.33%,琼脂扩散试验检出率为77.33%,竞争抑制ELISA方法较琼脂扩散试验方法敏感。[结论]该方法具有特异性高、快速、敏感等特点,适合检测山羊痘抗体。     

气肿疽梭菌PCR检测方法的建立

为建立气肿疽梭菌(Clostridium chauvoei)的快速检测方法,根据Gen Bank中气肿疽梭菌细胞毒素Cct A基因序列(登录号:JQ692583.1)设计了1对引物,以气肿疽梭菌标准株C54-1全基因组DNA为模板,建立了牛气肿疽梭菌的PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性试验。结果表明,建立的气肿疽梭菌PCR检测方法扩增出的片段大小为501 bp,与Gen Bank上气肿疽梭菌的同源性达99.4%,且该方法与D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌和巴氏杆菌等病原体无交叉反应,最低检测浓度为12.30 fg/μL。结果表明,建立的PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点,与其他诊断方法相比更适用于气肿疽梭菌的诊断。     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白竞争ELISA诊断方法的初步建立

利用表达的重组融合蛋白pGEX-6P-1-VP1作为抗原,用PET-32a-VP1蛋白免疫家兔获得的阳性血清作为FMDV阳性血清的竞争抗体,建立了检测FMDV抗体的竞争ELISA,并进行了条件优化,利用统计学方法计算竞争ELISA的阳性临界值。结果显示,重组蛋白抗原的最适包被质量浓度为1μg·mL~(-1),待检血清、酶标抗体和高免血清的最佳稀释度分别为1∶40、1∶2000和1∶500;与液相阻断ELISA试剂盒相比较,该方法的敏感性为91.3%,特异性为95.1%,符合率为96.7%。结果表明,该方法敏感性好、特异性强、重复性好,可用于O型FMDV血清抗体水平的检测。     

牛病毒性腹泻病毒夹心ELISA快速检测方法的建立与初步应用

用增殖与浓缩后的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)分别免疫健康牛犊和家兔,制备牛抗BVDV和兔抗BVDV超免疫血清,并用层析法纯化牛抗BVDV IgG和兔抗BVDV IgG,建立了检测BVDV的双抗体夹心ELISA快速检测方法.结果表明:该检测方法的最佳反应条件为:牛抗BVDV IgG包被浓度为100μg/mL,兔抗BVDV IgG最佳工作浓度为50μg/mL,样品反应时间为90min,酶标抗体工作浓度为1∶8 000,以D490nm≥0.177作为阳性判定标准.该ELISA检测方法的重复性CV小于10%,最低检测限为1.87μg/mL,与牛轮状病毒、牛冠状病毒、猪瘟病毒、犊牛大肠杆菌和沙门菌等病原无交叉反应,该ELISA试剂在室温下至少可保存6个月.用该ELISA方法和IDEXX公司抗原检测试剂盒对甘肃省不同地区牛场156份临床粪便样品进行了检测,阳性检出率分别为17.3%和16.7%.表明本试验建立的ELISA方法特异性强、敏感性高且重复性好,可用于BVDV的快速检测.     

仔猪血清大豆抗原蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】研究并建立大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法。【方法】首先用大豆抗原蛋白对仔猪进行致敏,然后采用棋盘滴定法确定最佳抗原包被质量浓度及血清稀释倍数,并对其他条件进行优化,最终建立检测血清大豆抗原蛋白11S、7S抗体的间接ELISA方法,确立待测血清判定标准,并对建立的ELISA方法进行重复性、准确性和敏感性检测。【结果】建立的ELISA方法的最佳反应条件为:11S抗原蛋白最适包被质量浓度为2.0μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间15min。7S抗原蛋白的最适包被质量浓度为2.5μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间25min。11S和7S抗原蛋白间接ELISA检测方法的批内、批间变异系数均小于10%,重复性较好,灵敏度较高。【结论】建立了仔猪血清大豆抗原蛋白抗体间接ELISA检测方法,该法具有很强的特异性和敏感性,可用于大豆抗原蛋白11S、7S过敏反应的临床诊断。     

新孢子虫病P43蛋白质(包涵体)的纯化及rELISA方法的建立

为建立新孢子虫病间接酶联免疫吸附试验(rELISA)检测方法,先诱导表达GST-P43包涵体蛋白,并对其进行提取、纯化、复性处理,再以复性后的P43蛋白作为抗原,优化rELISA检测方法。结果表明,这种包涵体处理方法,可使其纯度达到87%,复性后的目的蛋白具有良好的免疫活性。通过对rELISA各反应条件的优化,确定了最佳反应条件,血清稀释倍数为1∶100,抗原包被浓度为7μg/mL,封闭液为0.5%脱脂乳,酶标抗体的工作浓度为1∶4000,酶标抗体作用时间为1 h,底物作用时间25 min。且该方法不与弓形虫和布鲁氏菌病发生交叉反应。     

基于重组MTFP基因蛋白的犬心丝虫抗体Dot-ELISA检测方法的建立

以建立Dot-ELISA检测犬心丝虫血清抗体的方法,用纯化的犬心丝虫MTFP基因蛋白为包被抗原,进行条件优化,筛选最佳反应条件,并进行敏感性、重复性和特异性等试验。结果表明,建立的犬心丝虫Dot-ELISA检测方法最佳抗原包被浓度为0.5μg·片-1;待检样品血清最佳稀释比例为1∶50;HRP标记兔抗犬抗体最佳稀释比例为1∶4 000;建立的Dot-ELISA方法敏感性为1∶200;批间重复试验证明,该方法具有良好的重复性,且与犬等孢球虫阳性血清和犬蛔虫阳性血清没有交叉反应;利用建立的方法对吉林省某地的62份待检血清进行检测,结果阳性率为4.8%。研究成功建立了基于重组MTFP基因蛋白的犬心丝虫Dot-ELISA检测血清抗体方法,为犬心丝虫病流行病学调查和临床诊断提供了新技术。     

测定RHDV抗体的间接ELISA方法的建立

通过氯仿和PEG6000处理,SephadexG 200层析纯化RHDV抗原,建立了检测RHDV抗体的间接ELISA试验方法。该方法的抗原最适包被浓度为10μg/ml,血清样品最佳稀释度为1∶400。与血凝抑制试验方法(HI)等相比,该方法具有快速、简单、特异性和重复性好等优点。     

A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。     

酶联免疫吸附法检测黄精皂苷

利用效价为1∶12 800(方阵滴定法测得)的兔抗薯蓣皂苷多克隆抗体,建立黄精皂苷酶联免疫吸附(ELISA)检测方法。抗体的最佳稀释度为1∶3 000,包被抗原的最佳稀释度为1∶10 000;回归方程I=32.021 logC 189.02,相关系数R2=0.997 4,最低检测下限I10为2.468×10-3μg/mL。回收率为80.33%~103.88%,与人参皂苷和强心苷的交叉反应率分别为3.24%和7.48%。测得黄精总皂苷质量分数为0.1366%。     

绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法的建立及应用

利用绵羊肺炎支原体标准株Y98制备抗原,经超声破碎后作为包被抗原建立了间接ELISA检测方法用于检测绵羊肺炎支原体血清抗体.经方正滴定确定了抗原包被质量浓度为2.5μg.mL-1,血清样品稀释倍数为1∶64,兔抗羊IgG辣根过氧化物酶结合物最佳稀释倍数为1∶40000,抗原抗体最佳结合时间为1 h.试验结果确定的判定标准为:样品D490 nm(P)与标准阴性血清D490 nm(N)之比,即P/N≥3.0为阳性,P/N≤2.5为阴性,介于二者之间的为可疑.试验证明该方法具有良好的稳定性、重复性和特异性,并且与间接血凝试验相比较其敏感性高于后者.     

布鲁氏菌VirB12蛋白纯化及其抗体ELISA方法的初步建立

为获得高纯度布鲁氏菌VirB12蛋白,对VirB12分泌表达蛋白先后进行亲和纯化和离子交换纯化。将其作为抗原包被ELISA板,优化反应条件后初步建立了布鲁氏菌抗体的ELISA检测方法。结果表明:蛋白纯化效果良好,重组蛋白纯度可达到98%以上。在建立的ELISA中,纯化重组蛋白的最佳包被浓度为1μg·mL-1,最适封闭剂为5%脱脂奶粉,血清最佳稀释浓度为1∶25,酶标二抗最佳工作浓度为1∶1500。对20份阳性血清及12份阴性血清的检测结果表明,其与SUANOVIR Brucella-Ab C-ELISA试剂盒的总体符合率达到90.6%,表明本试验建立的以VirB12重组蛋白为抗原的ELISA方法可以检测布氏杆菌感染抗体,有望研制成试剂盒用于养殖场布病的检测和净化。     

玉米弯孢菌叶斑病菌ELISA检测方法的建立

利用玉米弯孢菌叶斑病病原菌菌丝蛋白作为抗原,制备了该病原菌菌丝蛋白的多克隆抗体,建立了检测玉米弯孢菌叶斑病菌的间接ELISA方法。结果表明,玉米弯孢菌抗血清的效价为1∶32 000;最佳抗原、抗体工作浓度分别为5μg/m l和1∶2 000;在最佳抗原抗体工作浓度下,理想包被液为碳酸盐缓冲液(pH值9.6),包被时间为4℃包被过夜;抗原抗体最适竞争反应时间为37℃下1 h;灵敏度为0.02μg/m l,此抗体可以与弯孢菌发生特异性反应,而与其他10种供试病原真菌的菌丝蛋白均呈阴性反应。