利用正交设计优化桃SRAP-PCR反应体系

以桃基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从Mg2+、Taq酶、dNTP、引物、模板5种因素4个水平对桃SRAP反应体系进行优化,建立了适合于桃的SRAP-PCR优化反应体系,该25μL反应体系:模板DNA50 ng,MgCl22.5 mmol/L,dNTP200μmol/L,上下引物各0.4μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U,以灭菌双蒸水补齐至25μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,5个循环;94℃变性1 min,50℃复性1 min,72℃延伸1 min,35个循环,72℃延伸10 min。     

沙地云杉ISSR-PCR反应体系的初步优化

以沙地云杉叶基因组DNA为材料,采用单因素试验方法对ISSR-PCR体系中的主要成分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度、退火温度进行筛选,建立并优化沙地ISSR-PCR反应体系。结果表明,UBC835是最适引物,适宜退火温度为50℃。沙地云杉ISSR-PCR分析的最适反应体系(20μL PCR反应体系)为:2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、0.25μmol/L引物、50 ng/μL模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,50℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。     

龙眼ISSR反应体系的建立和优化

对影响龙眼ISSR-PCR扩增反应的各个参数进行优化,建立适合龙眼的ISSR反应体系:PCR反应体积为20μl,其中模板DNA 25ng,引物0.2μmol/L,dNTP 100μmol/L,Taq DNA聚合酶0.5U,MgCl2 2.5mmol/L,10×PCR缓冲液2.0μl;扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性1min,退火温度1min,72℃延伸90s,40个循环;72℃延伸7min。     

大葱RAPD反应体系的优化

研究了大葱基因组DNA的提取方法,并对Mg2 浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶用量进行了优化,建立了RAPD最佳反应体系,即20μl反应体系中10×Buffer缓冲液2μl,Mg2 浓度2.5 mmol/L,dNTPs浓度0.22 mmol/L,引物浓度0.65μmol/L,Taq酶1 U(2.5 U/μl),模板DNA 60 ng,用灭菌超纯水补足20μl。扩增程序为:94℃预变性3 m in;94℃变性40 s,38℃退火45 s,72℃延伸1 m in,40个循环;最后72℃延伸10 m in。     

白桦SRAP反应体系的建立与优化

以白桦(Betula platyphlla Suk)基因组DNA为模板,利用趋势面设计对白桦SRAP-PCR反应体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物P)在3个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了白桦SRAP-PCR反应的最佳体系。该反应体系为20μL:0.21g/LDNA,1.5μL;25mmol/LMg2+,1.4μL;5U/μLTaq酶,0.25μL;2.5mmol/L,2μL;10μm/L引物,0.35μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min,30个循环,72℃延伸7min。     

黄皮RAPD-PCR反应体系的优化

以5′-GTCGTTCCTG-3′为随机引物,以酸黄皮为试材,对黄皮RAPD反应体系进行了优化研究,结果表明:20μL反应体系中,Taq DNA聚合酶、Mg2 、随机引物、模板DNA和dNTPs 5种主要成分的适宜浓度和用量分别为2.0 U、2.5 mmol/L、0.5 umol/L、50 ng、0.20 mmol/L。适宜的扩增程序为94℃预变性3 min,1个循环;94℃变性45 s,36℃退火45 s,72℃延伸1 min,38个循环;72℃后延伸7 min。     

冷暖型小麦基因差异的最佳RAPD反应体系研究

为了建立小麦RAPD反应的最佳体系,保证反应结果的稳定性和可靠性,寻找小麦冷暖型基因差异,降低试验成本,在相同PCR扩增程序(94℃预变性5 min,94℃变性45 s,38℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,40个循环,72℃延伸10 min,4℃保存)下,对冷暖型小麦基因组DNA的RAPD扩增体系各参数进行比较筛选,创建其最佳反应体系为:25μl反应体系中,模板DNA 20 ng,10×PCR缓冲液2.5μl,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq酶1 U,Mg2+浓度为2.0 mmol/L,ddH2O 12μl,随机引物10 ng。     

大百合RAPD体系的建立与优化

以大百合DNA为模板,采用正交试验设计,对影响大百合RAPD-PCR扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立大百合RAPD反应的优化体系。结果表明最优大百合RAPD-PCR的反应体系(20μl):Mg2 (2.0 mmol/L)1.0μl、dNTPs(0.2 mmol/L)1.0μl、primer(0.6 umol/L)1.3μl、DNA(30 ng/μl)1.0μl、Taq酶1U、10×buffer2μl;扩增程序为:在94℃下预变性5 min,然后进行35个循环(94℃变性30s、37℃退火50s、72℃延伸1 min),最后在72℃延伸10 min,在电压为50 V下电泳1 h。     

温郁金ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化

[目的]寻找一个可用于温郁金ISSR-PCR的最适宜反应体系。[方法]利用CTAB法提取基因组DNA,同时利用PCR扩增技术和方法,对引物、模板DNA、Mg2+d、NTP、Taq聚合酶等反应条件进行优化。[结果]反应体系的最佳条件是总体积为25μl,其中Mg2+浓度(25mmol/L)2.2μl,Taq聚合酶(5 U/μl)0.4μl,引物浓度(20μmol/L)1.5μl,模板DNA(5 ng/μl)1.5μl,dNTP(2.5 mmol/L)2.2μl,10×PCRbuffer2.5μl;PCR扩增程序为:1个循环的94℃预变性5 min;94℃变性35 s,相对应的引物退火温度退火1 min,72℃复性1.5 min,共36个循环;最后72℃延伸10 min。[结论]该体系是适合温郁金ISSR-PCR反应的最适宜体系,具有省时、经济、简便以及扩增条带清晰而稳定等特点,为今后温郁金遗传多样性的研究奠定了基础。     

马氏珠母贝ISSR-PCR反应条件优化

采用ISSR技术对马氏珠母贝进行PCR扩增,100个引物筛选出48个呈阳性反应的引物。对影响ISSR-PCR反应的Mg2+浓度、模板浓度T、aq酶浓度、引物退火温度和反应循环数进行了优化,并对甲酰胺对试验的影响进行了初步探讨。结果表明:优化的马氏珠母贝ISSR反应条件为①反应体系2.5μl 10×buffer,镁离子浓度1.5 mmol/L,Taq酶1.0 U,200 nmmol/L ISSR引物,模板浓度为50 ng/μl,2%甲酰胺,0.10 mmol/L dNTP,加双蒸水至总体积25μl;②反应程序预变性94℃,5 min;变性94℃,30 s;退火52℃,1 min;延伸72℃,2 min;39个循环;延伸72℃,7 min。     

枣cDNA-AFLP技术体系建立与优化

建立了枣(Ziziphus jujuba Mill.)cDNA-AFLP分析的优化体系和反应程序。提取获得的总RNA以人工合成的Oligo(dT)18为引物,利用鼠源反转录酶(M-MLV RT)合成cDNA第1链,合成双链cDNA后用限制性内切酶EcoRⅠ(识别6个碱基位点)与MseⅠ(识别4个碱基位点)酶切,酶切连接后,使用与接头序列互补的预扩引物对cDNA片段池进行PCR扩增,扩增后的cDNA池定量至1 ng/μL,作为选择性扩增的模板,优化得到的选扩反应体系为:20μL的反应体系中含5μL模板,2μL 10×PCR buffer,2μL MgCl2(25 mmol/L),EcoRⅠ特异性引物(50 ng/μL)1μL,MseⅠ特异性引物(50 ng/μL)1μL,10 mmol/L dNTP0.4μL,5 UTaqDNAPolymer-ase 0.12μL。选扩程序:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,65℃退火30 s(每个循环降0.7℃),72℃延伸1 min,13个循环;94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,31个循环;72℃7 min。     

葡萄基因组DNA的提取及RAPD条件优化

采用改良CTAB法提取葡萄属22种植物的基因组DNA,对其完整性进行了测定,通过单因素五水平试验,筛选模板、Mg2+、Taq酶、dNTPs和随机引物的浓度及其用量,建立了葡萄RAPD技术最优体系,即25 μL体积中模板DNA为40 ng·μL-1,MgCl２ 2.0 mmol·L-1,dNTP 0.8 mmol·L-1,Taq DNA 聚合酶1 U·μL-1,引物 0.8 μmol·L-1,建立了葡萄基因组DNA的RAPD 反应扩增程序,即94℃预变性4 min, 94℃循环变性 45 s,37℃退火 55 s,72℃ 延伸 80 s,40个循环,最后72℃ 延伸10 min。     

Establishment and Optimization of SRAP Amplification System in Lonicara caerulea L.

A single factor design was applied to optimize five factors influencing SRAP system, including Taq DNA polymerase, template DNA concentration, dNTPs, primer and Mg2＋, each at four levels. The optimal SRAP-PCR system for Lonicera caerulea L. was 20 ktL SRAP-PCR amplification reaction solution containing 2.0 μL 10×PCR buffer, 1.0 U Taq DNA polymerase, 30 ng template DNA, 0.2 mmol·L-1 dNTPs, 2.0 mmol·L-1 Mg2＋ and 0.2μmol·L-1 primer. The suitable amplification procedure consisted of an initial denaturation at 94℃ for 5 min; denaturation at 94℃ for 1 min, annealing at 35℃ for 1 rain, extension at 72℃ for 90 s and in total five cycles; denaturation at 94℃ for 1 min, annealing at 50℃ for 1 min, extension at 72℃ for 90 s and in total 35 cycles; extension at 72℃ for 8 rain; preservation at 4℃. The procedures and systems could meet the demand for SRAP amplification of Lonicera caerulea L. and would play an important role in Lonicera caerulea L. germplasm identification and genetic diversity analysis.     

南瓜RAPD分析体系的优化*

 为确保南瓜RAPD反应结果的稳定性和重复性，对MgCl₂浓度、dNTPs浓度、Taq酶含量、引物浓度、模板DNA浓度、复性温度、PCR循环次数等影响南瓜RAPD结果的重要因素进行了初步研究。最终优化的南瓜 RAPD反应体系为25 μL反应液中：10×反应 buffer（100 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L KCl, 80 mmol/L (NH₄)₂SO₄ ,pH 9.0,NP-40）2.5 μL, 3 mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L dNTPs，Taq酶l.0 U,引物15 ng/μL ，DNA模板10 ng/μL 。本研究最终确立的PCR反应程序为: 94 ℃预变性5 min,然后按94 ℃变性30 s,37 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s，进行40个循环,最后72 ℃延伸5 min。在此条件下得到的RAPD图谱可为南瓜遗传多样性、分子标记及辅助育种等研究提供有效的手段。     

椰子基因组DNA的提取及RAPD反应体系的优化

以椰子叶片为实验材料,探索了椰子基因组DNA的提取方法,并对影响RAPD反应的各因素进行了优化,建立了椰子的优化反应体系和程序。试验最终建立的椰子RAPD反应总体积为20μL,各有关成分的最佳浓度分别为Mg2＋2.5 mmol/L,Taq DNA0.75 U,dNTP 0.2 mmol/L,Primer 1μmol/μL,模板DNA2.5 ng/μL。PCR循环程序为：94℃预变性1.5min;94℃变性20 s,36℃退火20 s,72℃延伸45 s,35个循环;最后72℃延伸3 min。     

花吊丝竹ISSR反应体系的建立与优化

建立关于花吊丝竹的ISSR-PCR反应体系,为花吊丝竹种质资源鉴定提供理论基础。采用单因素试验法,对影响PCR扩增效果的Mg~(2+)浓度、d NTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度及模板DNA用量等5个PCR反应体系主要成分以及退火温度和循环次数进行分析,并利用建立的优化反应体系和扩增程序对100条候选引物进行筛选。结果表明,适合花吊丝竹的ISSR-PCR反应体系为:20μL的反应液中含3.0 mmol/L Mg~(2+)、0.20 mmol/L d NTPs、1.25 U Taq DNA聚合酶、0.6μmol/L引物、10 ng模板DNA、2μL 10×Buffer、8.55μL dd H_2O。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,52.7℃退火30 s,72℃延伸90 s,40个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。建立的花吊丝竹的ISSR-PCR反应体系能够扩增出清晰、多态性较高的条带,且筛选出的16条引物具有高度多态性。表明该体系具有较高的稳定性、重现性和适用性。     

苦楝RAPD反应体系的优化

以苦楝叶片提取的基因组DNA为材料,通过单因素多水平梯度试验,筛选DNA模板,Mg^2＋,Taq DNA聚合酶,dNTPs和随机引物的浓度及用量,建立苦楝RAPD技术分析体系.结果表明：当基因组DNA浓度为60 ng/μL,镁离子浓度为3.0 mmol/L,dNTP浓度为0.25 mmol/L,引物浓度为0.30μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1 U/20μL,反应体系总体积20μL时,出现可辨认的清晰谱带.其扩增程序为：94℃预变性2 m in;然后38个循环（94℃变性30 s,37℃退火1 min,72℃延伸80 s）;最后72℃延伸8 min,4℃保存.     

寒兰基因组DNA ISSR-PCR反应条件的优化

以改良的CTAB法提取的寒兰（Cymbidium kanran Makino）基因组DNA为模板,通过单因子试验建立最适的寒兰的ISS-PCR反应体系。结果表明,适宜寒兰ISSR-PCR反应体系的扩增条件为：25 μl PCR 反应体积中,1×PCR buffer,2.0 mmol/L MgCl2,300 ng 模板 DNA,200 μmol/L dNTP,1.40 U Taq DNA 聚合酶,0.4 μmol/L 引物。最佳扩增程序为：94 ℃预变性 5 min,然后进行40个循环：94 ℃ 变性 30 s,复性温度根据各引物的Tm值略低1～2 ℃,30 s,72 ℃ 延伸 50 s,循环结束后 72 ℃ 延伸7 min。