菜心ISSR-PCR反应体系的优化

以菜心(Brassica campestris L. ssp. Chinensis Var. utilis Tssen. et Lee.)为材料, 对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如Mg2 、 Taq DNA聚合酶、 dNTPs、 Primer、模版DNA的浓度及引物退火温度、延伸时间和循环次数进行了探讨, 确立了适合菜心ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数 在25 μL反应体系中含10×buffer 2.5μL, 2.0 mmol/L Mg2 , 0.5 U Taq DNA聚合酶, 0.2 mmol/L dNTPs, 0.5 μmol/L引物, 30 ng模板DNA. PCR扩增程序 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性1 min, 49.7～56 ℃退火(退火温度随引物不同而定)1 min, 72 ℃延伸45 s, 40个循环; 72 ℃延伸5 min.     

胡椒ISSR反应体系的建立与优化

旨在构建胡椒(Piper nigrum L.)基因组DNA的ISSR-PCR反应体系,以便为海南胡椒属植物的遗传多样性分析研究打下基础。利用单因素随机试验设计,对胡椒ISSR-PCR反应体系中各组分(TaqDNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、引物和Mg2+)的浓度进行优化,同时筛选ISSR-PCR反应的循环数和最适退火温度。确定了最优的ISSR-PCR反应体系为:总体积20μL,其中Taq DNA聚合酶1.0 U,dNTPs 0.8 mmol/L,引物0.2 mmol/L,Mg2+1.8 mmol/L,模板DNA 50 ng。同时通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度及最佳循环数。胡椒ISSR-PCR最佳反应程序为:95℃预变性5 min;94℃变性30 s,54.9℃(引物834)退火30 s,72℃延伸45 s,共计35个循环,循环结束后72℃延伸7 min,4℃保存。这一反应体系可成功地应用于海南胡椒属植物的遗传多样性分析。     

油橄榄ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选

[目的]对油橄榄ISSR-PCR反应体系进行优化,并筛选出多态性ISSR引物。[方法]以油橄榄嫩叶片提取的基因组DNA为模板,通过单因子试验针对反应体系主要因子Mg2+、dNTPs、引物浓度及模板用量进行油橄榄ISSR-PCR反应体系优化。[结果]优化的油橄榄ISSR-PCR反应体系为:总体系20μl中含1×Taq Buffer,3.5 mmol/L Mg2+,0.4 mmol/L dNTPs,1.0μmol/L引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,20 ng DNA模板。反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,52～55℃退火30 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。同时利用上述反应体系和反应程序筛选出了扩增稳定、多态性高、扩增条带清晰的ISSR引物11条。[结论]为进一步油橄榄种质资源的多样性研究和品种鉴定奠定了基础。     

春兰ISSR-PCR反应体系的优化

以春兰为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如模板DNA、dNTPs、MgCl2、primer、TaqDNA聚合酶的浓度及引物退火温度、反应循环数进行了探讨,确立了适合春兰ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数:在15μL反应体系中含1×buffer,0.2 mmol/L dNTPs,2.0 mmol/L MgCl2,0.2μmol/L引物,0.3 UTaqDNA聚合酶,20 ng模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性2.5 min;94℃变性45 s,48~58℃退火(退火温度随引物不同而定)45 s,72℃延伸2 min,35个循环;72℃延伸5 min。     

玉米自交系SSR技术反应体系的优化

以玉米自交系为材料,研究了PCR反应体系的Mg(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、模板DNA浓度及退火温度对玉米自交系SSR扩增结果的影响,确定适合玉米自交系SSR分子标记研究的优化体系.最终确定总反应体系为20μmol/L,Mg(2+)浓度3.0mmol/L、dNTPs 0.1mmol/L、引物0.45μmol/L、Taq DNA聚合酶0.4U、模板DNA 50ng.PCR扩增条件:94℃预变性5 min;94℃ 45s,56℃ 45s,72℃ 1 min,35个循环;最后72℃5 min.     

绿竹ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以绿竹基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对dNTPs、Mg~(2+)、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA设置7个不同浓度梯度进行研究,并对退火温度和循环次数进行筛选,建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序,并利用优化后的体系对100条ISSR引物进行筛选。最终确定的最佳反应体系为:20μL的扩增体系中,dNTPs浓度为0.2 mol/L,Mg2+浓度为2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.0 U,引物浓度为0.4μmol/L,DNA用量为50 ng,10×PCR buffer体积为2μL、剩余体积用灭菌dd H2O补全。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,(根据引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸90 s,循环38次;72℃延伸10 min,4℃保存。以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出14条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。本研究建立了绿竹ISSR-PCR最佳反应体系并筛选出高多态性引物,为绿竹的指纹图谱、遗传多样性分析、分子育种和品种鉴定等研究提供了基础。     

黄皮RAPD-PCR反应体系的优化

以5′-GTCGTTCCTG-3′为随机引物,以酸黄皮为试材,对黄皮RAPD反应体系进行了优化研究,结果表明:20μL反应体系中,Taq DNA聚合酶、Mg2 、随机引物、模板DNA和dNTPs 5种主要成分的适宜浓度和用量分别为2.0 U、2.5 mmol/L、0.5 umol/L、50 ng、0.20 mmol/L。适宜的扩增程序为94℃预变性3 min,1个循环;94℃变性45 s,36℃退火45 s,72℃延伸1 min,38个循环;72℃后延伸7 min。     

枣树基因组DNA提取及其RAPD体系优化

以不同生长期的枣和酸枣为研究对象,采用CTAB法提取枣基因组DNA;通过单因素5水平试验,筛选模板、Mg2+、Taq酶、dNTPs和随机引物的浓度及其用量,建立了枣和酸枣RAPD技术最优体系,即25μl反应体系中各组分含量为10×Taq Buffer+KCl 2.5μl;Taq DNA聚合酶0.04 U/μl;MgCl22.0 mmol/L;模板DNA2 ng/μl;引物0.3μmol/L;dNTP为0.2 mmol/L。适宜的扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃循环变性50 s,36℃退火50 s,72℃延伸1.5 min,38个循环;72℃延伸10 min。     

柽柳cpSSR-PCR反应体系的建立和优化

[目的]建立并优化柽柳cpSSR-PCR反应体系和反应条件。[方法]对影响PCR反应的5个变量(Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA浓度)进行L_(16)(4~5)正交试验设计,并对引物退火温度进行梯度筛选。[结果]最优反应体系:Mg~(2+) 2.0 mmol/L、dNTPs 0.125 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.25 U、引物0.25μmol/L、模板DNA 20 ng,共10μL。反应程序:94℃预变性4 min;94℃30 s,引物退火温度30 s,72℃30 s,30个循环;72℃延伸10 min。[结论]该反应体系成功扩增1个柽柳天然群体的23个个体,为柽柳群体扩散路线的确定奠定基础。     

大叶铁线莲ISSR反应体系的建立与优化

以秦岭野生大叶铁线莲为试验材料,在单因素试验的基础上进行L9(34)正交试验,从而优化大叶铁线莲ISSR-PCR反应体系。结果显示,在25μL反应体系中,最佳体系为1.0μL模板DNA、2.0μL Mg2+、2.0μL dNTPs、1.0μL引物以及0.2μL Taq DNA聚合酶和18.8μL ddH2O。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性50 s,47℃退火1 min,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸10 min,最后4℃保存。     

濒危植物巴东木莲ISSR分子标记技术体系的建立

利用正交设计建立和优化适合于濒危植物巴东木莲的ISSR-PCR分子标记技术体系.对影响ISSR-PCR反应的多个因素,包括引物和DNA模板浓度、Taq酶用量、Mg2 和dNTPs浓度以及PCR扩增的退火温度、退火时间及循环次数等进行了优化.结果表明,适于巴东木莲ISSR-PCR反应的分子标记技术体系为:反应总体积20μ1,含2μ1 10×buffer、1μ1 20 mmol/L Mgcl2、4μ1 2 pxaoL/L引物、0.4μ1 10 mmoL/L dNTPs、0.8μ1 5 u/μ1Taq酶及40 ng模板DNA;PCR扩增程序为:94℃预变性5 min,94 oC变性30 8,54 oC复性45 s,72℃延伸1.5min,35个循环,最后72℃延伸7 min.本研究建立的ISSR分子标记技术体系稳定性强,重复性高.     

菜心ISSR-PCR反应体系的优化

以菜心（Brassica campestris L．ssp．Chinensis Var．utilis Tssen．et Lee．）为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如Mg^2＋、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Primer、模版DNA的浓度及引物退火温度、延伸时间和循环次数进行了探讨,确立了适合菜心ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数：在25pL反应体系中含10×buffer 2．5μL,2．0mmol／LMg^2＋,0．5U Taq DNA聚合酶,0．2mmol／LdNTPs,0．5μmol／L引物,30ng模板DNA．PCR扩增程序：94℃预变性3min;94℃变性1min,49．7～56℃退火（退火温度随引物不同而定）1min,72℃延伸45s,40个循环;72℃延伸5min．     

荷花ISSR-PCR反应体系的建立及优化

以荷花叶片提取的基因组DNA为材料,通过对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等进行筛选和优化,确立了可用于荷花ISSR-PCR分析的最适宜的PCR反应体系:20μL PCR反应体积含0.4 mmol.L-1dNTPs、3.5 mmol.L-1Mg2+、1.5 UTaqDNA聚合酶、0.4μmol.μL-1引物、3 ng模板DNA。PCR扩增程序为:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,54.5℃退火30 s,72℃延伸1 min,45个循环,最后72℃延伸7 min,置4℃保存。应用该ISSR体系对6份荷花种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

长蛸ISSR-PCR优化反应体系的建立及优化研究

以长蛸DNA为模板,利用单因子试验分别对影响长蛸ISSR-PCR反应的DNA浓度、Taq DNA聚合酶、Mg2＋、dNTPs和引物的浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最适退火温度,最终确定长蛸最佳反应体系和PCR扩增程序为：25μL体系,其中包括Taq DNA聚合酶1.5 U,Mg2＋2 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.4μmol/L,DNA模板量约50 ng确立退火温度为52℃。利用所建立的ISSR-PCR反应体系,通过对24份野生长蛸样本的检验,获得了清晰、重复性好、多态性高的条带,研究结果对于把ISSR标记技术引入研究长蛸不同地理群体遗传多样性和遗传结构具有重要意义。     

菠菜ISSR-PCR体系的建立与优化

以菠菜雌雄成株的幼嫩叶片为材料,用改良2×CTAB法提取基因组DNA,研究影响菠菜ISSR-PCR的因素,分别对模板浓度、Mg2+浓度、引物浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶浓度进行优化,建立了适用于菠菜ISSR-PCR的反应体系(25μL):模板用量为60 ng、引物浓度为0.4 μmol/L、Mg2+浓度为2.0 mmol/L、dNTPs用量为0.2 mmol/L、Taq酶用量为0.5U.扩增程序为95℃预变性5 min,94℃变性1 min,52℃退火1 min,72℃延伸2 min,循环35次,72℃延伸8 min.该体系以菠菜雌雄株进行扩增验证,得到的条带清晰、多态性高、重复性高,且在雌株中发现特异条带.     

用正交设计法优化辣椒ISSR-PCR反应体系

采用正交设计L16(45)对辣椒ISSR-PCR反应体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物浓度)在4水平上进行优化试验。结果表明,最佳反应体系为:在25μl总反应体系中,含1×PCR缓冲液、2.0 mmol Mg2+、1.5 unitTaqDNA聚合酶、0.25 mmoldNTP、0.48μmol引物、120 ng模扳DNA。扩增程序为:95℃预变性5 min;94℃变性45 s,51℃退火1 min,72℃延伸2min,进行38个循环;最后72℃延伸10 min。新优化的辣椒ISSR-PCR反应体系和程序有很好的重复性和稳定性。此研究为今后利用ISSR技术对辣椒进行种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位提供了一个较理想的应用方案。     

苦楝RAPD反应体系的优化

以苦楝叶片提取的基因组DNA为材料,通过单因素多水平梯度试验,筛选DNA模板,Mg^2＋,Taq DNA聚合酶,dNTPs和随机引物的浓度及用量,建立苦楝RAPD技术分析体系.结果表明：当基因组DNA浓度为60 ng/μL,镁离子浓度为3.0 mmol/L,dNTP浓度为0.25 mmol/L,引物浓度为0.30μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1 U/20μL,反应体系总体积20μL时,出现可辨认的清晰谱带.其扩增程序为：94℃预变性2 m in;然后38个循环（94℃变性30 s,37℃退火1 min,72℃延伸80 s）;最后72℃延伸8 min,4℃保存.     

福建含笑ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以福建含笑叶片提取的基因组DNA为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,确立了可用于福建含笑ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件:20μL PCR反应体积中含0.4 mmol.L-1dNTPs,2.5 mmol.L-1Mg2+,1.5 UTaqDNA聚合酶,0.6μmol.μL-1引物,30 ng模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,47.3℃退火30 s,72℃延伸1 min,45个循环,72℃延伸7 min,4℃保存。应用ISSR体系对5份福建含笑种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

麻楝ISSR-PCR反应体系的建立及优化

模板DNA、引物、三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）,镁离子（Mg2+）浓度、Taq DNA聚合酶的用量以及退火温度是影响简单序列重复区间扩增?鄄聚合酶链式反应（ISSR-PCR）的主要因素。以麻楝Chukrasia tabularis叶片基因组DNA为试验材料,系统地测试这6个因素对麻楝ISSR-PCR反应结果的影响。结果表明:最优的反应体系为20 L反应体系中含30 ng模板DNA,1.00 molL－1随机引物,0.15 mmolL-1dNTPs,2.50 mmolL－1 Mg2+,2.50 16.67 nkat Taq DNA聚合酶。最佳退火温度为56 ℃,ISSR-PCR反应程序为94 ℃预变性5.0 min,94 ℃变性45 s,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸1.5 min,40个循环;72 ℃再延伸7.0 min,4 ℃保存。应用优化的ISSR-PCR反应体系对24份麻楝个体材料进行扩增,均能扩增出丰富稳定的条带。图8表1参27     

濒危植物沉水樟ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为从分子水平上探讨濒危物种沉水樟种质资源的保护机制,以其基因组DNA为模版,开展ISSR-PCR反应体系的研究,对各反应因子水平、引物退火温度和循环参数进行优化,确定适于沉水樟ISSR-PCR反应的最佳体系：20 μL反应体系中各反应物的最适含量为模板75 ng、引物0.4μmol/L、dNTP 200 μmol/L、Taq酶1.25 U、Mg2＋ 1.5 mmol/L;扩增程序为：94℃预变性7 min; 94℃变性30 s,53.0～58.0℃退火45 s,72℃延伸90 s,45个循环;72℃延伸7 min,4℃保存.