农杆菌介导的AtMYB118基因转化橡胶树易碎胚性愈伤组织体系优化

[目的]采用正交设计L25(56)优化农杆菌介导的AtMYB118基因对橡胶树易碎胚性愈伤组织的遗传转化体系,为橡胶树品种遗传改良提供参考.[方法]以75.0 mg/L卡那霉素筛选经过转化的愈伤组织;采用GUS瞬时表达检测方法评价6个因素即预培养时间、农杆菌菌液浓度(OD600)、乙酰丁香酮(AS)浓度、侵染时间、共培养温度和共培养时间对遗传转化的影响.[结果]6个因素显著影响橡胶树长期培养的易碎胚性愈伤组织的转化频率,易碎胚性愈伤组织遗传转化优化条件为:预培养0d,菌液OD600为0.7,侵染时间7 min,共培养时间5d,AS 200 μmol/L,共培养温度25℃.在此优化条件下可获得最高转化频率.经过4~6个月的筛选,获得17个GUS染色阳性的易碎愈伤组织系.经PCR和反转录PCR分析转化愈伤组织,进一步证实uidA、nptⅡ、AtMYB118基因已被整合到愈伤组织基因组中并表达.培养获得1539个胚状体,其中164个为转基因胚状体,转化频率为10.6%;最终获得4株转AtMYB118基因植株.[结论]优化获得可行有效的橡胶树易碎胚性愈伤组织遗传转化体系,可为其品种遗传改良提供技术支持.     

黑花生再生体系和遗传转化的初步研究

以黑花生品种黑霸920成熟种胚、幼叶和胚轴为外植体，对黑花生植株再生和遗传转化进行了研究。通过设置一系列不同浓度激素配比的培养基来优化各阶段培养条件，初步建立了高效的黑花生再生体系，即花生种子经75％乙醇表面消毒15min，MS＋6-BA2．0mg／L为最优化的种子萌发培养基，MS＋2，4-D2．0mg／L为最佳诱导愈伤培养基，幼叶为最佳诱导愈伤组织的外植体，MS＋6-BA8mg／L＋NAA0．5mg／L＋AgNO3 1mg／L为最佳分化培养基，MS＋NAA2．0mg／L＋6-BA0．2mg／L＋活性炭200mg／L为最佳生根培养基。同时确定了愈伤组织和幼苗的卡那霉素筛选压分别为30mg／L和300mg／L。利用农杆菌介导法将含有GUS基因和NPTⅡ基因的植物表达栽体pBI121导入花生组织，在对愈伤组织、幼叶和胚轴的GUS表达检测中均有蓝色斑块出现，证明GUS基因已成功转入到花生细胞中。     

基因枪轰击高粱愈伤组织获得转基因植株

利用基因枪轰击高粱幼穗愈伤组织，把Bt蛋白基因转移到体细胞中，在20mg／L潮霉素选择培养基上筛选到抗性愈伤组织，并分化出10株再生植株。对经过潮霉素抗性筛选再生的绿色植株取叶片进行GUS活性分析，从10株再生植株中GUS阳性反应的7株，另有3株无GUS表达。对GUS活性表达阳性的植株，利用：PCR和Southern杂交分析，对GUS活性表达阳性的植株7株中，6株扩增出0．6kb左右的DNA杂交信号带，说明Bt已整和到高粱基因组中。以基因枪法将Bt基因转移高粱愈伤组织过程中，高效的组织培养和再生体系的建立是转基因成功的重要因素之一。在遗传转化过程中应避免转基因的嵌合体现象，通过抗生素的浓度及培养时间，可以降低转基因的嵌合体频率。     

橡胶树HbHMGR1基因克隆及其愈伤组织转化

[目的]克隆橡胶树HbHMGR1基因,转化橡胶树易碎愈伤组织,为橡胶树遗传转化和品种改良打下基础.[方法]根据已经报道的HbHMGR1基因序列（NCBI登录号X54659.1）设计特异引物,通过RT-PCR克隆HbHMGR1基因,构建pCAMBIA2301-35 S-HbHMGR1植物表达载体.再用EHA105（携带pCAMBIA2301-35 S-HbHMGR1,内含NPTⅡ和uidA基因）侵染橡胶树易碎愈伤组织,数月筛选后对抗性易碎愈伤组织系进行GUS染色和分子检测.[结果]成功克隆了HbHMGR1基因,双酶切重组质粒、重组质粒的PCR扩增结果证明成功地构建了该基因的植物表达载体pCAMBI-A2301-35S-HbHMGR1.侵染后抗性橡胶树易碎胚性愈伤组织GUS检测为蓝色,且分子检测呈现阳性,共获得15个抗性易碎愈伤组织系.[结论]橡胶树HbHMGR1基因在愈伤组织阶段开始表达,有效提高了HbHMGR1基因在橡胶中的表达量.     

巴西橡胶树的离体微繁殖

以取自巴西橡胶树Hevea brasiliensis Muell．Arg．）种子实生苗的腋芽为外植体，利用含1．0mg／LKT，1．0mg／L2，4-D，20g／L蔗糖，以及4g／L琼脂粉的Ms培养基成功获得腋芽无菌苗。将其转入附加S．0Fng／LNAA，3．0me4LIBA，50g／L蔗糖，以及4g／L琼脂粉的MS培养基可进一步诱导生根。试验中我们还发现，尽管从叶片及腋芽外植体均能诱导出大量愈伤组织，但最终均未能实现体细胞胚胎发生及植株再生。采用合适的培养基能够诱导腋芽外植体离体萌发并生根，这一结果表明，通过进一步的研究和探索，完全有可能借助该途径建立巴西橡胶树的高效离体微繁体系。     

一段烟草核基质结合区的分离及对转基因表达的效果

 采用PCR方法，从烟草基因组中分离了一段核基质结合区（matrix attachment region，MAR），将其构建到β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因（uidA）的两侧翼，形成MARs调控的植物表达载体，将此表达载体与不含MARs序列的植物表达载体通过农杆菌转化烟草。对转基因植株进行GUS活性定量测定，结果表明，MAR可以提高外源uidA基因的表达水平，与不含MAR的转化植株相比，外源基因的平均表达水平提高了1.5倍，最高达6倍，但MAR的引入不能降低转基因植株个体间表达水平的差异。     

巴西橡胶树未成熟花药的体细胞胚胎发生及植株再生

以巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell．Arg．）的未成熟花药为外植体成功实现高频体细胞胚胎发生及植株再生。筛选出的最佳愈伤组织诱导培养基为：改良MS＋2,4-D2．0mg／L＋KT0．5mg／L,最佳体细胞胚胎诱导培养基则为：改良MS＋KT0．7mg／L＋NAA0．2mg／L。将成熟体胚转移至无激素培养基中可进一步发育出根、茎、叶完整的小植株。细胞学分析显示,所有受检小植株均为二倍体。将长至2—3cm高的小植株移栽到营养袋中并置于温室条件下育苗,随后可定植到大田。     

根癌农杆菌介导半夏凝集素基因pBIXPTA对百合的转化

以百合花丝诱导的胚性愈伤组织为基因转化的受体材料，利用根癌农杆菌介导法将pBIXPTA基因导入百合，组织化学法检测转化后共培养3d的组织块，GUS瞬时表达率可达60％，选择培养20d的组织中约有1％检测到GUS基因的稳定表达。菌液浓度ODeoo值为0．8左右时侵染效果较好，同时于附加100μmol／L的AS可提高转化效率。PCR分子捡测转基因植株部分呈现阳性，初步证明外源基因已整合到百合基因组中。     

利用高效农杆菌遗传转化系统将ACP反义基因片段导入油菜

通过对已有的油菜农杆菌遗传转化体系的改进，建立了一种利用农杆菌感染油菜子叶柄的高效遗传转化方法，经过农杆菌感染的子叶柄在含有6-BA2．0mg／L，IBA0．15mg／L，AgNO33．5mg／L的MS培养基上由卡那霉素抗性愈伤组织分化出抗性幼苗的频率达到12．28％。利用已经构建的含有油菜Napin启动子加上反义ACP脱饱和酶第一外显子、内含子的基因片段的植物双元表达载体pNACP，将该反义ACP基因片段转入油菜“沪油15”；PCR和GUS染色结果表明抗性植株中有60％的植株含有导入的目的基因。这为油菜籽脂肪酸遗传改良提供了一种新的方法。     

农杆菌介导雪莲PBP基因对棉花的遗传转化研究

雪莲磷脂酰乙醇胺结合蛋白（Phosphatidyl ethanolamine-binding family protein, PBP）基因表达产物与细胞膜的冷稳定性有关，可能在植物抗寒方面起一定作用。本研究将XLPBP基因以农杆菌介导的方法转化新陆早17号、新陆早13号、新陆早1号3个品种陆地棉，通过对不同激素浓度、预培养时间、菌液浓度和浸菌时间等因素对转化培养物的影响以及茎段外植体对卡那霉素（Kan）的敏感性等方面的探讨，确定了新陆早13号外植体材料（茎段）的最佳转化条件，即：在OD600为0．4的农杆菌菌液中侵染10min，在茎段最适培养基（含0．1mg／LKT和0．1mg／L2，4-D，pH5．8）上进行预培养2d，共培养2d，转至不含选择压的培养基（含Cef 500 mg／L）上进行延迟培养7d，再进行选择培养，茎段愈伤分化达25％（诱导出愈伤组织的外植体数占接种的外植体数）以上；茎段转化适宜的选择压力为Kan 50 mg／L；在获得的抗性愈伤中8％左右经检测为GUS阳性。     

农杆菌介导的薹菜遗传转化体系研究

以薹菜子叶-子叶柄为外植体,研究了根癌农杆菌介导的遗传转化技术。用含GUS和NPTⅡ基因的农杆菌侵染子叶-子叶柄,获得了具有卡那霉素抗性的再生植株。再生植株经GUS组织染色,证实外源基因转化到植物基因组中。卡那霉素敏感性测定结果表明,当培养基中含卡那霉素（Km）15 mg/L时,非转化再生植株全部白化。转基因抗性芽筛选的适宜的卡那霉素浓度为10 mg/L。     

橡胶树乳管特异性启动子连接HbHMGR1基因的易碎胚性愈伤组织转化

[目的]以3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶1基因(HbHMGR1)乳管表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化橡胶树易碎胚性愈伤组织,获得抗性转基因材料,为研究HbHMGR1基因的乳管特异性表达及提高橡胶产量打下基础.[方法]用根癌农杆菌EHA105介导表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化橡胶树品种热研8-79花药易碎胚性愈伤组织,经卡那霉素筛选数月后,对抗性愈伤组织进行GUS染色和分子检测.[结果]经过对根癌农杆菌侵染的易碎愈伤组织进行4~6个月筛选,得到5个GUS检测呈阳性的抗性愈伤组织系;取其中的2号和11号抗性愈伤组织系进行PCR鉴定,均能扩增出与阳性对照相同的特异片段,uidA、NPTⅡ和PHEV2.1-HbHMGR1序列的目的片段大小分别为829、797和3592bp.2号和11号抗性愈伤组织系经反向PCR鉴定,发现2号抗性愈伤组织系未扩增出目的条带,而11号抗性愈伤组织系扩增获得一条约2000 bp的条带,包含T-DNA序列和一段未知的DNA序列,其中未知DNA序列是橡胶树品种热研8-79基因组的一段连续序列.[结论]将植物表达载体的T-DNA整合到抗性愈伤组织系基因组DNA中,可获得一个含35S-NPTⅡ-PHEV2.1-HbHMGR1-35S-uidA的转基因愈伤组织系.     

花生组织培养及苗期npt Ⅱ标记基因筛选剂适宜浓度的研究

选用丰花1号、丰花2号两个花生品种,分组织培养和苗期试验两部分,组织培养试验选用再生芽丛和离体幼叶两种外植体,进行花生对卡那霉素、新霉素和G418三种常用的nptⅡ标记基因筛选剂的敏感性检验。研究表明,400mg/L的卡那霉素、500mg/L的新霉素或25mg/L的G418能明显抑制花生再生芽丛的生长,使其变为黄色或褐色,丧失长成植株的能力;培养基中含有100mg/L卡那霉素或300mg/L新霉素或10mg/LG418都能有效抑制非转基因离体幼叶脱分化成愈伤组织。苗期试验设置了0,0．1,1．0,5．0,10．0g/L5个卡那霉素浓度,在三叶期涂抹花生未展开叶,研究表明,5g/L卡那霉素使非转基因的被涂抹叶全部出现大而明显的黄色斑。     

农杆菌介导的紫穗槐茎段愈伤组织遗传转化研究

采用农杆菌介导法对紫穗槐茎段诱导的愈伤组织进行遗传转化研究。确定了卡那霉素临界耐受浓度为40mg/L。菌液浓度与侵染时间的正交试验结果表明:侵染菌液OD600为0.8、侵染时间为30min时转化效率最高,达17.95%。GUS染色检测分析表明:含pBI121-GUS质粒DNA农杆菌侵染转化的愈伤组织其抗性不定芽和再生植株根和叶均呈蓝色。转化植株叶PCR检测结果表明外源GUS基因已整合到紫穗槐基因组中。以上结果表明建立了以茎段诱导愈伤组织为转化受体、农杆菌介导的紫穗槐高效遗传转化体系。为了验证其可重复性,又进行了pBI121-GFP基因的转化,T0代再生植株PCR检测整合率达85%,在488nm蓝光源激发下转化株的顶芽产生绿色荧光,说明转入的基因在35S启动子下过量表达。此遗传转化体系可应用于转基因育种。     

Xα21基因导入水稻广亲和恢复系SWR20的研究

以成熟胚愈伤组织为转化受体，经农杆菌介导法将显性广谱白叶枯病抗性基因Xα21导入高感白叶枯病的水稻广亲和恢复系SWR20中，共获得43个独立的转基因株系，100余株转基因水稻植株，经GUS活性，潮霉素抗性检测及PCR分析表明，外源基因已整合到转基因水稻基因组中，白叶枯病原菌接种试验表明，大部分T0代转基因水稻植株的抗病性有明显提高，多数植株抗或高,抗，个别为感病，经对农杆菌介导的水稻转化技术作进一步改进后，GUS瞬间表达率可高达 92．5％，稳定转化频率达到27．6％。α     

用基因枪法将Bt杀虫基因导入水稻愈伤组织的研究

从水稻成熟胚诱导出的愈伤组织经继代培养后可以产生大量的胚性愈伤组织。本研究采用基因枪法转化上述胚性愈伤组织 ,在附加羧苄青霉素 (5 0 0 μg· m L-1)和卡那霉素 (5 0 μg·m L-1)的选择培养基上进行抗性愈伤组织的筛选 ,在附加羧苄青霉素 (5 0 0 μg· m L-1)和卡那霉素 (2 5 μg· m L-1)的分化培养基上诱导抗性芽。GUS酶活性检测和对基因组 DNA作 PCR检测结果均为阳性 ,证明外源目的基因 (Bt)已在寒地水稻抗性愈伤组织中整合并表达。抗性再生植株的 GUS酶活性及 PCR检测正在进行中     

白桦抗虫基因转化的初步研究

用根癌农杆菌介导法对白桦（Betula platyphylla)进行转化，获得了转化再生植株。卡那霉素抗性愈伤组织产生率达10%-22%，抗性不定枝的生根率达80%以上。经分子生物学检测，在卡那霉素抗性转化植株中，有34%检测出GUS活性，76.5%的卡那霉素抗性植株的Southern斑点杂交呈阳性反应。初步证明，抗虫基因已转入白桦中。     

根癌农杆菌介导Bt杀虫基因对花椰菜的转化初报

采用 Ti质粒 p KSB带有 Bt杀虫蛋白基因、NPT 选择标记基因及 GUS基因 ,通过根癌农杆菌 L BA40 44菌株的介导 ,将 Bt杀虫基因导入花椰菜品种中。试验以花椰菜下胚轴为外植体 ,将下胚轴切段置于分化培养基 (MS+ 6 - BA1 .0～ 2 .0mg/L + NAA 0～ 0 .5 mg/L)上 ,对影响转化的种种因素进行了试验。得到了转化的愈伤组织及再生植株 ,用组织化学法检测 GUS活性 ,观察到愈伤组织内的转化细胞呈阳性蓝色反应     

重穗型恢复系蜀恢527成熟胚高频率植株再生及其基因转化的研究

以籼稻重穗型恢复系蜀恢527的成熟胚为外植体,研究了影响其愈伤组织诱导及植株再生频率的各种因素。结果表明。在基本培养基NMB中添加2．0mg／L的2,4-D有利于蜀恢527成熟胚愈伤组织的诱导和继代培养;MS＋6-BA2．0mg／L＋KT2．0mg／L＋NAA0．25mg／L的分化培养基有利于愈伤组织的分化;继代两次的愈伤组织分化率最高。利用本研究建立了适合蜀恢527成熟胚遗传转化的高效植株再生体系,在此基础上利用农杆菌介导法将稻瘟病抗性基因Pi-d2导入蜀恢527并获得了经PCR检测为阳性的转化植株。     

农杆菌介导遗传转化云蔗05-51

【目的】建立云蔗05-51组培再生体系明确其对抗生素G418的耐受性,为云蔗05-51基因工程遗传改良提供参考。【方法】以云蔗05-51心叶为外植体,MS基本培养基添加2, 4-D、6-BA和KT,设置质量浓度梯度及不同激素配比,诱导愈伤组织及其分化植株。在云蔗05-51胚性愈伤组织增殖与不定芽分化阶段,培养基中添加不同含量的G418,确定合适的G418筛选质量浓度。以nptⅡ为标记基因,农杆菌介导遗传转化云蔗05-51胚性愈伤组织,筛选获得抗性植株,PCR和NPTⅡImmunoStrip检测确定nptⅡ基因的整合与表达。【结果】云蔗05-51愈伤组织诱导与增殖阶段,适宜的培养基配方为MS基本培养基添加3.0 mg/L 2, 4-D;愈伤组织分化不定芽阶段宜采用MS基本培养基添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。云蔗05-51对G418耐受性筛选结果显示:愈伤组织增殖阶段和分化不定芽阶段G418的适宜筛选质量浓度分别为40和20 mg/L。G418抗性植株PCR检验表明:标记基因nptⅡ已成功整合到云蔗05-51转基因植株基因组中;NPTⅡImmunoStrip检测表明:nptⅡ的蛋白水平得以表达。【结论】建立了云蔗05-51心叶组培再生体系,明确了40和20 mg/L G418是筛选抗性愈伤和抗性植株的适宜质量浓度。建立了农杆菌介导遗传转化云蔗05-51胚性愈伤组织系统,为有益基因导入甘蔗品种提供了参考。