γ-亚麻酸在RAW264.7细胞中的抗炎症作用机制

[目的]探讨γ-亚麻酸（GLA）对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞产生炎症介质的影响及其机制。[方法]以体外培养的巨噬细胞系RAW264.7细胞为研究对象,待细胞生长至融合状态后加入不同浓度（0、12.5、25、50μmol/L）的GLA预孵4 h,利用100 ng/m l的脂多糖（LPS）刺激12.0 h或0.5 h,同时设空白对照和LPS对照,利用蛋白印迹法检测诱生型一氧化氮合酶（iNOS）、环加氧酶-2（COX-2）蛋白的表达以及对IκBα、p-JNK/SAPK（Thr183/Tyr185）、p38 MAPK、p-p38 MAPK（Thr 180/Tyr182）、ERK1/2、p-ERK1/2的影响。[结果]GLA可以显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中iNOS和COX-2的蛋白表达（P〈0.05）,且在0~50μmol/L GLA浓度范围内存在剂量依赖关系。GLA可以显著抑制IκBα的降解（P〈0.05）,从而抑制NFκ-B的激活。GLA可以显著抑制LPS诱导的JNK1/2以及ERK1/2的磷酸化（P〈0.05）,对p38的磷酸化没有显著影响。[结论]GLA具有很好的消炎功效。抑制JNK1/2和ERK1/2的磷酸化、抑制NF-κB的激活可能是GLA发挥生物学效应的重要机制。     

齐墩果酸抑制脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症反应

通过CCK-8法检测齐墩果酸对巨噬细胞增殖的影响;采用Griess试剂检测细胞培养液中NO含量,通过Western Blot法分析iNOS蛋白表达和MAPK通路p38,ERK和JNK蛋白表达和磷酸化状态,研究齐墩果酸对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞RAW264.7炎症反应的影响,探讨齐墩果酸抗感染作用及机制。结果表明:齐墩果酸(100.0μmol·L~(-1))明显抑制巨噬细胞增殖(P0.05);12.5~100.0μmol·L~(-1)的齐墩果酸能够显著抑制脂多糖诱导巨噬细胞分泌NO(P0.01),并能显著抑制LPS诱导iNOS蛋白的表达;LPS作用后能够激活ERK通路,抑制p38和JNK通路磷酸化,齐墩果酸作用后,能显著抑制ERK磷酸化,促进JNK和p38蛋白的磷酸化。证明齐墩果酸能显著降低脂多糖诱导巨噬细胞分泌NO,通过抑制iNOS的表达和双向调控MAPK通路蛋白磷酸化达到抗感染作用。     

原花青素对脂多糖诱导的环氧合酶-2表达的抑制作用

以脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞为模型,研究原花青素对LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞中环氧合酶-2(COX-2)mRNA转录的抑制机制。采用RT-PCR法测定原花青素对LPS诱导的RAW264.7细胞中COX-2mRNA转录的影响,采用Western blot和免疫组化法考察原花青素对LPS诱导的RAW264.7细胞核转录因子κB(NF-κB)亚基p65(NF-κB/p65)及NF-κB结合蛋白(I-κB)表达的影响。结果发现LPS处理RAW264.7细胞可以明显上调COX-2 mRNA的表达,同时降低胞质蛋白I-κB的表达水平,增加NF-κB的水平。原花青素对RAW264.7细胞中COX-2 mRNA的转录有较强抑制作用,抑制NF-κB/p65的表达及I-κB的降解,原花青素可能是通过抑制NF-κB/p65的表达及I-κB/p65的降解而抑制COX-2的表达。     

紫檀茋影响脂多糖诱导巨噬细胞炎症因子的变化

采用脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264. 7建立炎症模型,评价紫檀茋的抗炎作用。在LPS刺激的RAW264. 7细胞中,添加紫檀茋进行干预,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)方法检测细胞中炎症因子单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1),白细胞介素6 (IL-6),白细胞介素1β(IL-1β),肿瘤坏死因子α(TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表达量,Griess法检测培养基中一氧化氮(NO)的释放量,采用Western blotting方法进一步检测细胞中细胞外调节蛋白激酶(ERK),c-Jun氨基末端激酶(JNK),p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和核转录因子κB-p65 (NF-κB p65)的蛋白磷酸化水平。结果发现:紫檀茋能够显著抑制炎症因子基因的表达和炎症介质NO的释放;紫檀茋+LPS组中ERK,p38和p65的蛋白磷酸化水平显著下降。紫檀茋能显著抑制炎症因子MCP-1,IL-6,IL-1β,TNF-α和iNOS的mRNA表达和NO的释放,其机制可能与阻断丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB信号通路相关。     

千里光石油醚提取物对LPS激活的炎症反应的抑制效应

以千里光石油醚提取物（PEESS）为材料，以脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7小鼠单核巨噬细胞为炎症模型，通过CCK-8法检测细胞增殖、Griess法检测一氧化氮（NO）含量、RT-PCR法检测炎症相关因子的表达，及Western blot法检测炎症关键转录激活因子的活化，研究PEESS的抗炎作用及可能的分子机制。结果显示，0~80 μg/mL的PEESS对巨噬细胞增殖无明显影响，但能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的分泌，并呈浓度依赖性；炎症相关因子基因mRNA表达检测结果显示：PEESS能显著抑制LPS刺激的RAW264.7 细胞炎症模型中IL-1β及IL-6的表达；同时，PEESS还显著降低了NF-κB p65及 p44/p22 MAPK蛋白的磷酸化水平。以上结果表明，千里光石油醚提取物对LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症模型具有较好的抗炎效应，其作用发挥可能与其抑制NF-κB和MAPK信号通路的活化以及NO、IL-1β和IL-6等炎症介质的分泌有关。     

异荭草苷通过MAPK/FoxO信号通路减轻LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应

为了研究异荭草苷(Isoorientin, ISO)对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响及其机制,将对数生长期的RAW264.7细胞随机分为对照组、模型组(LPS 1μg·mL^-1)和异荭草苷(ISO 2.5～40μg·mL^-1+LPS)给药组。各组细胞培养24 h后,MTT法检测ISO对RAW 264.7细胞毒性,Griess法检测细胞培养液中一氧化氮(NO)的含量,ELISA法检测细胞培养液中TNF-α的含量,q RT-PCR方法检测环氧合酶2(COX-2)m RNA的表达水平,蛋白质印迹分析法测定细胞中COX-2、JNK、p-JNK、p38、p-p38、FoxO1和FoxO3蛋白的表达。结果表明,与LPS模型组比较,ISO显著抑制LPS诱导的TNF-α(P<0.001)和NO(P<0.01)的产生,且未见其细胞毒性。此外,ISO以剂量依赖的方式显著抑制RAW 264.7细胞COX-2基因(P<0.001)和蛋白(P<0.05)的表达。蛋白质印迹分析显示...     

预防性给予生物活性肽对巨噬细胞抵御LPS刺激的调节作用

预防性给予巨噬细胞(RAW264.7细胞)不同浓度的生物活性肽Gln-Glu-Pro-Val(QEPV)后,用脂多糖(LPS)刺激细胞,通过检测细胞因子表达和炎性蛋白基因转录,观察生物活性肽QEPV对细胞抵御LPS刺激的调节作用。结果表明,0.1g/L的QEPV有显著的促进细胞增殖作用,0.5g/L浓度以下的QEPV对RAW264.7细胞无增殖抑制作用。0.5g/L QEPV预处理RAW264.7细胞后,用LPS刺激细胞,其IL-6、IL-12等促炎细胞因子的分泌降低,抗炎细胞因子IL-10分泌提前,分泌量增加,COX-2、iNOS基因的转录水平降低,说明乳源性生物活性肽QEPV对RAW264.7细胞抵御LPS刺激起正向调节作用。     

野生蒙古口蘑多糖通过NFE2L2通路对LPS诱导的巨噬细胞发挥抗炎和抗氧化调节作用

目的:研究蒙古口蘑多糖提取物对脂多糖诱导小鼠单核巨噬细胞的抗炎和抗氧化保护作用的机理。方法与结果:蒙古口蘑多糖提取物对RAW264.7的作用与LPS模型组相比,蒙古口蘑多糖提取物在下列浓度0.01、0.1、1、10μg/mL均能有效抑制NO、TNF-α和IL-6的产生;在浓度为10μg/ml的蒙古口蘑多糖提取物作用下,除NF-κB外NFE2L2、iNOS和HO-1的mRNA的表达量均显著升高;免疫印迹的结果表明,除NF-κB外NFE2L2、iNOS和HO-1的蛋白的表达量均有不同程度的升高。结论:蒙古口蘑多糖提取物对LPS诱导的RAW264.7具有保护作用,其抗炎抗氧化的机制通过NFE2L2和i NOS信号通路实现,而不主要通过NF-κB信号通路发挥作用。     

益生菌Lactobacillus Casei Zhang对巨噬细胞中NO/iNOS表达的影响及其机制

目的:研究益生菌L.Casei Zhang对巨噬细胞RAW264.7中NO/iNOS表达的影响及探讨相关机制。方法:1×10~6CFU益生菌L.Casei Zhang与巨噬细胞RAW264.7细胞共培养2h,6h,12h,24h。收集细胞培养上清,检测NO的表达变化。通过Real-rime PCR检测iNOS、TLR2和TLR4表达的变化。L.Casei Zhang与RAW264.7共培养3h后,以LPS、CpG和PolyI:C刺激细胞,检测NO和iNOS表达的变化。结果:益生菌L.Casei Zhang促进了巨噬细胞中NO分泌和iNOS的表达。与TLR2的本底表达相比,L.Casei Zhang上调了RAW264.7细胞中TLR2的表达。TLR4 mRNA的表达在L.Casei Zhang与RAW264.7细胞共培养后2h显著增高。LPS和PolyI:C活化的巨噬细胞在L.Casei Zhang预处理后,NO/iNOS的表达水平显著降低。结论:益生菌L.Casei Zhang促进巨噬细胞中NO/iNOS的表达与促进TLR2和TLR4的表达有关。L.Casei Zhang抑制了LPS和PolyI:C诱导的巨噬细胞中NO/iNOS的表达。该研究为进一步阐明益生菌的免疫调节作用奠定了基础。     

白背天葵不同提取部位抗炎活性及机制研究

为研究白背天葵不同极性部位的抗炎效果及其机制,采用LPS诱导巨噬细胞RAW264.7建立炎症模型。Griess法检测白背天葵不同极性部位对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响;ELISA法测定细胞分泌TNF-α,IL-1β,IL-6及PGE2的含量;运用Western blot检测不同极性部位对LPS诱导的RAW264.7细胞核内NF-κB p65蛋白表达的影响。结果表明,白背天葵各极性部位均能不同程度地抑制LPS诱导的NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的过量分泌和细胞核内NF-κB p65的蛋白表达,白背天葵正丁醇相和乙酸乙酯相能显著抑制LPS诱导的PGE2的分泌。综上,白背天葵的抗炎作用可能是通过抑制NF-κB p65通路活化,进而抑制炎症介质和促炎细胞因子的合成和释放来实现的。     

MiR-155在脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应中的表达研究

[目的]探讨miR-155在脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应中的表达及糖皮质激素(GCs)的干预影响。[方法]体外培养RAW 264.7巨噬细胞,分别用浓度为10.0、1.0、0.1μg/ml LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞,于2、6、12、24、36 h 5个时间点收集上清用ELISA检测白介素-6(IL-6)蛋白浓度;实时定量-PCR检测miR-155在2、6、12、36 h 4个时间点的表达变化。[结果]IL-6在各浓度LPS处理组、各时间点其含量均高于对照组(CK);miR-155的表达在各时间点LPS组均高于LPS+GCs和CK。[结论]LPS可以诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应,炎症反应时miR-155高表达,糖皮质激素可抑制miR-155的表达。     

猪圆环病毒2型体外诱导RAW264.7细胞氧化应激模型的建立

[目的]探讨猪圆环病毒2型(PCV2)感染量、感染时间与被感染RAW264.7细胞活性氧水平动态变化的相关性,为建立RAW264.7细胞氧化胁迫体外模型提供参考依据.[方法]PCV2原液调至5×106/mL,经10、102、103和104倍稀释(10-1、10-2、10-3和10-4释度)后,感染作用RAW264.7细胞2h,弃病毒液,加入含5% FBS的DMEM培养液继续培养,分别于第4、8、12、24和48 h收集细胞上清液或细胞,测定一氧化氮(NO)、活性氧自由基(ROS)、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、髓过氧化物酶(MPO)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)等指标.[结果]10-1PCV2感染RAW264.7细胞后能有效升高细胞NO、ROS水平,降低细胞GSH水平和GSH/GSSG,升高细胞XOD、MPO和iNOS活性,表明以10-1pcv2感染RAW264.7细胞一定程度上能改变细胞氧化还原状态,诱导细胞产生氧化应激.[结论]PCV2感染能诱导RAW264.7细胞发生氧化应激,并确立10-1 PCV2(5× 105/mL)体外感染RAW264.7细胞4~24 h是建立RAW264.7细胞氧化胁迫模型的最佳条件.     

基于血清药理学方法的头花蓼抗炎有效提取物筛选

[目的]通过血清药理学方法,研究头花蓼不同提取物及热淋清颗粒含药血清对小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞)释放炎症因子的影响,筛选出头花蓼抗炎有效提取物。[方法]采用头花蓼血清药理学评价方法,10 ng/m L脂多糖(LPS)建立RAW264.7细胞炎症损伤模型,MTT法检测细胞存活率,Griess试剂法检测细胞上清液中NO的释放量,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中TNF-α和IL-6的释放量,以考察头花蓼水提物、水提醇沉提取物、水提醇沉沉淀物及热淋清颗粒含药血清(WEPS、PCWEPS、DPCWEPS、RLQS)对巨噬细胞释放炎症因子的影响。[结果]与模型组比较,WEPS、PCWEPS、DPCWEPS、RLQS均能显著抑制LPS刺激的RAW 264.7细胞释放炎症因子NO、TNF-α和IL-6,PCWEPS组抑制细胞释放NO、TNF-α和IL-6的作用最强。[结论]头花蓼水提醇沉提取物为头花蓼主要的抗炎有效提取物。     

刺五加对巨噬细胞产生NO与肿瘤坏死因子-α的抑制作用

用不同浓度刺五加提取物培养RAW264.7巨噬细胞,采用LPS与IFN-γ作为诱导剂,37℃培养24h,Griess试剂检测培养上清液中的NO含量,ELISA法检测培养上清液中的TNF-α含量。结果表明:刺五加提取物在浓度10～1000mg/L内对RAW264.7巨噬细胞分泌的NO具有极显著抑制作用(P<0.01),且呈剂量和时间依赖关系;刺五加提取物对TNF-α的分泌没有影响。这表明刺五加提取物可以显著抑制RAW264.7巨噬细胞产生的NO,而对肿瘤坏死因子-α的产生无明显抑制作用。     

咯利普兰通过MAPK/ERK信号通路抑制中性粒细胞的黏附

【目的】研究磷酸二酯酶4(PDE4)特异性抑制剂咯利普兰抑制中性粒细胞黏附的有关分子机制,明确其抗炎的主要信号通路,为PDE4选择性中药抑制剂的药理研究提供参考。【方法】猪中性粒细胞的提取采用密度梯度离心法,中性粒细胞与猪内皮细胞的黏附采用虎红比色法,中性粒细胞黏附分LFA-1和Mac-1表达量的检测采用流式细胞技术,中性粒细胞p38MAPK、ERK等磷酸化活性检测采用western blot法。【结果】咯利普兰可显著抑制fMLP刺激的中性粒细胞和内皮细胞的黏附(P0.05),极显著抑制fMLP刺激的中性粒细胞LFA-1和Mac-1的表达(P0.01),阻断fMLP刺激的中性粒细胞ERK磷酸化活性(P0.01),而对p38MAPK磷酸化活性无显著影响。【结论】咯利普兰可抑制中性粒细胞和内皮细胞黏附,其机制与阻断中性粒细胞ERK磷酸化进而抑制LFA-1和Mac-1表达有关。     

辛伐他汀对内毒素所致脓毒症大鼠肾组织NF-κB、iNOS表达的影响

目的了解辛伐他汀对脓毒症大鼠肾组织病理变化和肾组织核转录因子-κB（NF-κB）蛋白、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表达的影响。方法成年SPF级雄性SD大鼠90只,随机分为A组（生理盐水静脉推注）、B组（内毒素5mg／kg静脉推注）、C组（内毒素5mg／kg＋辛伐他汀20mg／kg,静脉推注）,每组30只。每组分别在2、4、6、12、24h时点随机处死6只大鼠,取右下肾组织,观察肾组织病理变化,免疫组化检测NF-κB蛋白及iNOS蛋白表达。结果A组肾小球、肾小管结构正常;B组白细胞浸润,肾小管损伤明显;C组肾病理损伤减轻。A组NF-κB蛋白及iNOS蛋白表达只有微量表达,B组表达较A组增加（P〈0．01）,C组表达较B组减少（P〈0．05）。结论辛伐他汀能抑制NF-κB和iNOS蛋白的过量表达,减轻脓毒症时肾组织的病理性炎症损伤。     

无刺蜂蜂胶乙醇提取物的体外抗氧化及抗炎活性

【目的】 无刺蜂(stingless bees)是热带和亚热带地区重要的授粉昆虫之一,以尾部无蛰针为典型特征,其蜂胶采集量较意大利蜜蜂（ Apis mellifera ligustica ）更多,然而其蜂胶活性研究却相对匮乏。本文以来源于马来西亚无刺蜂 ( Heterotrigona itama )采集蜂胶的乙醇提取物(ethanol extract of H. itama propolis, EEHI)为研究对象,旨在探究其体外抗氧化和抗炎活性。【方法】 采用福林酚法和硝酸铝法测定EEHI中总酚酸和总黄酮含量,并采用DPPH和ABTS ^+·自由基清除能力评价EEHI的体外抗氧化能力;在此基础上,采用细菌脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7炎症模型,通过CCK-8法检测EEHI对细胞相对存活率的影响,在保证EEHI对细胞无细胞毒性作用基础上,分别采用Griess法和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术评估EEHI对LPS诱导的RAW 264.7细胞中炎症介质一氧化氮（NO）释放量的影响以及其对炎症因子（ IL-1β 、 IL-10 和 INOS ）和抗氧化基因（ HO-1 ）信使RNA表达的影响;进一步利用免疫印迹和免疫荧光方法,以NF-κB炎症信号通路为切入点,研究EEHI对LPS诱导巨噬细胞中p-IκΒ α 和IκΒ α 蛋白表达以及NF-κB-p65蛋白移位的影响,从而探究EEHI潜在的抗炎机理。 【结果】 EEHI中总酚酸和总黄酮含量分别为54.70 mg GAE·g^-1和116.20 mg QE·g^-1;DPPH和ABTS^+·自由基清除能力IC₅₀值分别为275.60和 284.00 μg·mL^-1。EEHI对RAW 264.7细胞的安全浓度为0—40 μg·mL^-1。在LPS诱导的Raw 264.7细胞炎症模型中,相对于LPS刺激组,0—40 μg·mL^-1的EEHI以浓度依赖方式显著地抑制了LPS诱导的RAW 264.7细胞中NO的释放量,且降低了细胞中炎症因子 IL-1β 、 IL-10 和 INOS 的基因表达量,并增强了抗氧化基因 HO-1 的表达。进一步研究发现,0—40 μg·mL^-1的EEHI以浓度依赖方式显著抑制了LPS诱导的RAW 264.7细胞IκΒ α 蛋白的磷酸化,且40 μg·mL^-1的EEHI显著降低了NF-κB-p65蛋白的核移位现象,因此推测EEHI可能是通过抑制LPS诱导的NF-κB信号通路的激活进而发挥了体外抗炎活性。 【结论】 无刺蜂蜂胶乙醇提取物中含有大量多酚类化合物,具有较好的抗炎和抗氧化效果,极具开发利用价值。     

小鼠TLR3基因双敲除打靶载体构建及巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系的建立

[目的]建立Toll样受体3(TLR3)基因缺失的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系,为探索狂犬病毒感染机体过程中TLR3在固有免疫反应中的作用机制提供理论依据.[方法]采用Golden Gate Kit试剂盒组装转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)打靶载体pTALEN-TLR3,经酶切和测序验证其连接正确后,通过脂质体瞬时转染RAW264.7细胞,转染后提取细胞DNA,用T7核酸内切酶酶切验证TALEN质粒剪切活性.[结果]TALENs左右臂分两部分连接,首先完成A、B部分的各自连接,然后分别将T1LA与T1LB、T1RA与T1RB、T2LA与T2LB、T2RA与T2RB连接,TALEN模块经过两次连接后的PCR鉴定结果显示,T1L、T1R和T2L的4个克隆均呈阳性,T2R有3个克隆呈阳性.T2L和T2R质粒共转染RAW264.7细胞后提取DNA为模板,经PCR扩增后用T7核酸内切酶进行酶切,酶切后的DNA电泳结果显示TALEN2剪切活性较强,共获得3条条带(931、555和376 bp).TALEN打靶载体pTALEN-TLR3转染RAW264.7细胞24 h后用胰酶进行消化,并加入800μg/mL G418进行筛选,7 d后获得细胞单克隆;挑选阳性细胞克隆进行T7核酸内切酶酶切鉴定及测序,结果发现4-1和4-40号细胞克隆为双敲细胞系,均缺失7 bp的核苷酸碱基,为非3整数倍碱基缺失,可造成后续基因移码突变,使细胞基因功能失活.[结论]通过TALEN技术可成功构建TLR3基因双敲除的小鼠巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系,且可用于狂犬病毒感染细胞后细胞因子和TLR3间的关系研究.