猪胸膜肺炎放线杆菌山东分离株的血清型与Apx毒素型研究

 从山东省不同地区采集的85份具有严重呼吸道症状病死猪的肺脏、气管和扁桃体进行胸膜肺炎放线杆菌（APP）的分离鉴定，采用凝集试验和PCR方法对分离菌株进行血清型和APX毒素型的检测。结果从山东省不同地区分离到20株分属5个血清型的APP，其中，血清7型6株、血清5型5株、血清3型4株、血清4型3株、血清8型2株，血清7型、5型为优势血清型。不同地区分离的APP血清型不同，同一地区也存在不同的血清型。PCR检测结果表明，不同血清型的 APP共含有4种溶血毒素(Apx)，其中，血清3、4、8型APP含ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ，血清5型含ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅣ，血清7型含ApxⅡ和ApxⅣ，20株APP分离株均含有ApxⅡ和ApxⅣ两种毒素，表明野毒株的血清型与毒素基因的种类有一定的相关性。毒素序列分析结果表明，相同毒素型APP，其毒素基因序列的同源性在99.5％~100％之间，与血清型无关。致病性试验结果表明，所含毒素类型不同的APP对小白鼠的致病性不同，其中含ApxⅠ和ApxⅡ的血清5型APP毒力最强。该研究为猪传染性胸膜肺炎的免疫预防、亚单位疫苗的研制及基于ApxⅣ的PCR检测奠定了基础。     

二温式PCR检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌方法的建立与应用

为了探索简便、快速确诊猪传染性胸膜肺炎的方法,根据猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)apx IV基因序列,设计合成1对特异性引物,建立聚合酶链反应(PCR)检测APP的方法。采用该方法对APP和其他6种猪病病原核酸进行检测,结果只对APP扩增出与预期大小相符的422bp DNA片段,而对其他6种猪病病原核酸的扩增结果为阴性。该PCR最低可检出10pg的APP DNA。对送检的46份可疑病猪组织进行检测,结果有19份样品为阳性,27份为其他病原感染。     

重叠片断PCR方法构建猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ C突变载体pBSCA(-)

通过PCR克隆得到了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型完整的apxⅡC基因和部分apxⅡA基因约2 000 bp,通过重叠片段PCR方法使apxⅡC基因缺失,并将该DNA片段克隆到PBS-T载体中构建了apxⅡC基因失活的转移载体pBSCA(-),为构建猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型apxⅡC缺失菌株打下基础。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌变异株的分离与鉴定

对江苏泰兴某猪场疑似猪传染性胸膜肺炎病料进行实验室分离培养,成功分离到1株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌,并对其进行生化特性、双抗夹心ELISA鉴定。为进一步分析该分离株的血清型,针对ApxIVA和ApfA保守基因设计2对检测引物,PCR结果表明:该分离株未扩增出预期大小的片段,说明该分离株很有可能是1株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌变异株,其血清型还有待进一步鉴定。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP诊断方法的建立及耐药性调查

为建立快速诊断猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)的方法和耐药情况,根据Gen Bank中的APP apx IVA基因,设计合成2对引物,通过环介导等温扩增技术(LAMP)扩增条件的优化,建立了APP LAMP诊断方法,同时对分离到的APP进行耐药性分析。结果显示,建立的LAMP诊断方法最低核酸检测量为2 pg/μL,对猪源大肠杆菌、猪源沙门氏菌、猪源支原体、副猪嗜血杆菌、猪源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性,扩增反应30 min内完成,结果肉眼可见。分离得到的31株APP,耐药性较强。结果表明,建立的方法可满足基层现场快速检测需要,对分离得到的31株APP耐药性分析表明,APP耐药性较严重。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定、致病性与药敏试验

从湖北省几个猪场具有严重呼吸道症状的疑似病例中,采集了肺脏、扁桃体、关节液及心包液等病料,进行了细菌的分离培养及菌落形态观察、染色镜检、生化试验、PCR检验、血清型鉴定、药敏试验及致病性试验.结果表明,分离到的8株细菌为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP).血清型分型鉴定结果为1型的6株,3型的2株.药敏试验结果显示,分离的菌株对头孢类、先锋霉素类表现较高的敏感性,为猪场用药提供了科学参考.     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血素的研究进展

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种呼吸道疾病。根据荚膜多糖和脂多糖抗原表位不同,将胸膜肺炎放线杆菌分为15个血清型,不同血清型的菌株毒力大小不同,致病性也有强弱之别。该菌的致病性与多种毒力因子密切相关,而溶血素是决定该病原菌致病性强弱的关键因素。本文主要就其溶血素的研究进展作综述。     

用PCR检测猪胸膜肺炎放线杆菌

为了快速诊断猪的传染性胸膜肺炎，试验设计合成了1对引物，建立了检测猪胸膜炎肺放线杆菌的PCR方法，猪胸膜炎肺放线杆菌Ⅰ型菌血清2、5、6、9、10型均能扩增出预期片段；大肠杆菌，猪痢疾蛇形螺旋体、多杀性巴氏杆菌、鸡葡萄球菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性，用该方法检测了自猪肺脏分离的30个菌株，有11株为阳性，19株为阴性，结果证实，本方法可以用于猪胸膜肺炎的快速诊断。     

我国局部猪胸膜肺炎流行调查和血清型分析

为了解我国猪传染性胸膜肺炎的流行情况及其病原胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleurnopneumoniae,简称APP)的主要血清型,1990年~2014年我们对我国23省市不同养猪场进行了流行病学调查。调查结果表明,该病在我国23个省市均有发生,先后从山东、深圳、上海、河北、江苏、河南等省、市的临床病例和送检病料中分离到APP病原62株。其中已鉴定、定型的菌株59株,所涉及的型株为1型4株、2型11株、3型3株、5型18株、7型19株、8型1株、未定型3株。根据我们对全国流行病学调查和病原分离鉴定各型分离株的多少及其毒力的强弱比较分析,本病危害我国养猪业发展的主要血清型为7型、5型和1型。     

猪传染性胸膜肺炎临床诊断与防治

正猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(APP)所致的一种高度接触性、致死性呼吸道疾病,同时巴氏杆菌也是引起坏死性胸膜肺炎的病原,胸膜放线杆菌属革兰氏阴性小球杆菌,具有气囊,且多行性。1胸膜肺炎放线杆菌致病性猪是本菌高度专一性的宿主,寄生在扁桃体和呼吸道,具有高度宿主特异性,在最急性和急性感染期间,不仅发现有肺脏的损伤,而且鼻子也有大量的分泌物,本病的潜伏期     

仔猪多发性关节炎病原菌的分离鉴定及耐药性研究

从山东地区32个猪场发生多发性关节炎的仔猪体内分离到15株病原菌。通过对分离菌株的形态染色、分离培养、生化试验及种特异性基因的PCR扩增等方法鉴定菌株,结果显示4株分离菌株为副猪嗜血杆菌,7株为猪链球菌,2株为化脓隐秘杆菌,1株为猪胸膜肺炎放线杆菌,1株为猪丹毒杆菌。15株分离菌均对昆明小鼠有较强的致病力,且对先锋霉素类抗生素高度敏感,大多数菌株还对青霉素类、头孢菌素Ⅲ类、氟喹诺酮类、万古霉素、壮观霉素等抗生素高度敏感。该试验表明山东地区猪场仔猪多发性关节炎的病原菌主要是副猪嗜血杆菌和猪链球菌,可交替使用上述敏感抗生素防治该病。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌江西株的分离鉴定及PCR诊断

从江西南昌地区一些猪场的疑似猪传染性胸膜肺炎放线杆菌典型病例中,采集病猪的病变组织,经细菌分离得到3个分离菌株JXAV-AIII0611、JXAV-AVII0611、JXAV-AX0611,经涂片染色镜检、培养性状观察、生化鉴定以及药敏试验证实该致病菌为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)。同时利用APP的oml基因设计引物,通过PCR成功扩增出预期的基因片段,为快速诊断该病打下了基础。     

猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌多重PCR检测方法的建立和应用

根据已发表的猪呼吸道疾病主要致病菌猪链球菌(SS)、胸膜肺炎放线杆菌(APP)和副猪嗜血杆菌(HPS)基因序列合成3对特异性引物,通过单一PCR和三重PCR体系及条件优化,建立这3种致病菌的三重PCR检测方法,并对200份临床表观健康猪鼻拭子样品用三重PCR方法进行检测。结果显示:建立的三重PCR方法能对同一样品中的SS、APP、HPS 3种病原菌的DNA模板进行扩增,无交叉反应;对猪体内常见的猪多杀性巴氏杆菌、猪大肠杆菌、猪放线杆菌、猪葡萄球菌、猪丹毒杆菌、猪沙门氏菌进行扩增,并无任何扩增产物;对SS、APP、HPS细菌纯培养物的检测敏感性分别为1×10~4CFU/ml、1×10~3CFU/ml、1×10~3CFU/ml;对人工模拟SS、APP、HPS感染组织样品的敏感性均为1×10~4CFU/ml。三重PCR方法对200份临床表观健康猪鼻拭子样品的检测结果显示:SS阳性160份,阳性率80.0%;APP阳性3份,阳性1.5%;HPS阳性45份,阳性22.5%。分别用细菌分离法和三重PCR法对30份临床病料进行检测,两者检测结果的符合率达到93%。建立的三重PCR可在4.5 h左右得到检测结果。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定及floR基因检测

为探究猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)临床分离株对氟苯尼考(FFC)的耐药性及floR基因的流行与分布情况,收集河南、湖北、江西、陕西、湖南、山西、安徽等7个省份合作猪场送检的病死猪肺脏、脾脏、支气管黏液等206份病料样本,从中分离APP并鉴定,采用微量肉汤稀释法测定分离菌株对FFC的敏感性,PCR及测序方法检测floR基因,并用随机引物PCR(AP-PCR)方法分析临床分离菌株之间的同源性。结果表明,成功分离鉴定了APP 28株,分离率为13.59%。4株APP对FFC耐药,耐药率为14.29%;15株携带floR基因,floR检出率为53.57%,高于APP对FFC的耐药率;有11株分离菌floR阳性但对FFC并不耐药。分析RAPD系统树状图发现,28株APP被分为几乎无核苷酸同源性的A和B 2大类、25种RAPD型,其中A类25株,分22种RAPD型,14株携带floR基因,这些菌株间的核苷酸同源性为40%～80%;B类3株,分3种RAPD型,1株携带floR基因。本研究提示APP的floR基因主要以水平方式传播。     

猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅱ型分泌蛋白结构与功能的研究

猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起猪传染性胸膜肺炎,是猪的最重要呼吸道传染病之一。通过筛选APP 3～8 kb随机基因组文库,获得1株阳性克隆。测序拯救质粒得到序列,通过BLAST分析确定此片段为APP Ⅱ型分泌蛋白基因,预计成熟蛋白分子量为45.716 KD。根据序列设计特异性引物PCR扩增该基因,分子克隆表达该Ⅱ型分泌蛋白。Western blot结果表明,该蛋白与APP康复期血清发生反应;研究还发现,纯化的Ⅱ型分泌蛋白能结合C3。     

山西省猪胸膜肺炎放线杆菌分离及药敏实验

为了解山西省胸膜肺炎放线杆菌的流行分布及耐药情况,以确定有效的防控措施和用药计划,从山西省20个猪场采集疑似猪传染性胸膜肺炎的病料组织,经分离培养、生化鉴定、PCR检测和药敏实验。确定3株分离株为猪胸膜肺炎放线杆菌。药敏实验结果表明,3株菌对头孢克肟、氟苯尼考和氨苄西林最为敏感;对阿莫西林、恩诺沙星、环丙沙星等7种抗菌药物为中敏;而对链霉素、庆大霉素、强力霉素、四环素和氯霉素表现出耐药性。     

猪传染性胸膜肺炎的综合防制技术

猪传染性胸膜肺炎,是由胸膜肺炎放线杆菌引起猪的一种高度接触传染性、致死性呼吸道传染病。本病病原为胸膜肺炎放线杆菌（APP）。     

猪传染性胸膜肺炎的实验室诊断

采用生化试验、间接血凝试验对送检的疑似猪传染性胸膜肺炎病猪的病料及血清进行诊断和药敏试验。结果表明,从病猪肺脏中分离到1株疑似胸膜肺炎放线杆菌,其革兰氏染色为阴性球杆菌,在普通营养琼脂和麦康凯培养基上不能生长,在TSA平板上形成不透明的淡灰色、湿润、光滑、表面隆起的菌落,血凝试验为阳性,确定所分离菌为胸膜肺炎放线杆菌。同时对该猪群随机抽检12份血样,用猪胸膜肺炎间接血凝试剂盒检测胸膜肺炎抗体,其阳性率为8.3%。药敏试验表明,磺胺间甲氧嘧啶钠和长效痢清为敏感药物。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5a型ApxⅣA全基因的序列测序及其分子特征

根据GenBank上公布的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清型1型和血清型3型ApxⅣA基因全序列,设计了7对引物,对APP血清5a型毒株263株ApxⅣA基因全序列进行了分段PCR扩增和克隆。序列测定结果表明:该基因核酸序列全长5856 bp,比GenBank上公布的血清1型和3型的相应基因核酸序列分别长438 bp和1287 bp,与其核酸和氨基酸序列同源率均分别为95.5%和87.6%;与GenBank刚公布的血清5b型毒株L20株的核酸和氨基酸序列的同源性均为98.2%。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白具有较强的亲水性,共有66个抗原决定簇,存在较多的可能性功能位点。     

复合PCR鉴定巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的方法

在已经建立的多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件和引物的筛选,成功地建立了PM、HIS复合PCR诊断方法,利用一次PCR反应,即可同时扩增多杀性巴氏杆菌的457 bp和副猪嗜血杆菌的1 090 bp的特异性片段.检测灵敏度分别达7.2 Pg DNA/1 040 CFU和16.0 Pg DNA/2 300CFU,用所建方法检测临床分离的23株可疑菌株和本实验室人工感染猪分离菌,结果显示,23株可疑株有2株检出多杀性巴氏杆菌特异性条带,没有检出副猪嗜血杆菌特异性条带;人工感染分离菌株均扩增出副猪嗜血杆菌特异性条带.表明该方法能够对临床上这2种疾病进行鉴别诊断.