Cell Ultrastructure of Kiwifruit （Actinidia chinensis） Shoot Tips During Cryopreservation

The changes in the cell ultrastructure of in vitro cultured shoot tips from dwarf genotype of kiwifruit （Actinidia chinensis Ganmi 5） during cryopreservation were investigated. Shoot tips were preserved in liquid nitrogen using vitrification, and the cell ultrastructure was examined using transmission electron microscopy （TEM）. The regular ultrastructure of the cell wall, cell membrane and nucleus of shoot tips could be damaged during the freezing and thawing associated with preservation using liquid nitrogen. The cell plasmolysis was increased and freezing tolerance was improved after precultufing and dehydrating in a preservation and vitrification solution （PVS2） （30% glycerol （Gly）＋ 15% ethylene glycol （EG）＋ 15% dimethylsulfoxide （DMSO） ＋ 0.4 mol L^-1 sucrose）. The structure of some cells with low degree of injury and reversible damage was similar to that of the control and they could undergo normal cell division and differentiation. Besides, they could recover automatically and regenerate after their reculture.     

梨离体茎尖超低温保存方法的比较研究

以梨为试材 ,从操作程序、存活率、再生方式及恢复生长速度等方面对 3种超低温保存方法进行了比较研究。结果表明 ,采用简单玻璃化法超低温保存梨离体茎尖的效果最佳。     

包埋玻璃化法超低温保存灰杨休眠茎尖的研究

采用包埋玻璃化法,对灰杨休眠茎尖进行了超低温保存研究。将灰杨休眠茎尖包埋在含3%褐藻酸钙的胶球中,研究了预培养中的蔗糖浓度、培养时间和不同玻璃化保护液处理时间对灰杨休眠茎尖存活率的影响。结果表明:含灰杨茎尖的胶球在0.8 mol/L的蔗糖溶液中培养24 h,可获得较高的存活率;胶球经玻璃化保护液[40%甘油+45%(0.4 mol/L)蔗糖+10%聚乙二醇(分子量4 000)+5%二甲基亚砜]在25℃处理20 m in,可以显著提高其存活率,在优化条件下存活率可高达58.3%。     

扁桃茎尖包埋玻璃化超低温保存条件研究

采用包埋玻璃化法对莎车18号扁桃茎尖超低温保存进行了研究。主要探讨低温锻炼、预处理浓度和预处理时间、装载时间和PVS2处理时间对莎车18号扁桃茎尖超低温保存后存活率的影响。结果表明,将低温锻炼4周的莎车18号扁桃茎尖切2 mm长用3%海藻酸钠包埋后,在含有0.3 mg/L蔗糖＋5%DMSO（二甲基亚砜）的MS培养基预培养1 d,装载液处理20min,在0℃条件下用PVS2处理50 min后迅速投入液氮,24 h后取出,放入40℃水浴锅中化冻1～2 min,用1.2 mg/L蔗糖的MS洗涤液洗涤2次,每次10 min,接种于含6-BA0.3 mg/L和IAA 0.3 mg/L的MS培养基上进行培养,暗培养15 d,转移至正常光下,存活率高达52%。     

蜜蜂幼虫冷冻技术研究

以西方蜜蜂幼虫为材料,采用玻璃化冷冻方法,研究了蜜蜂幼虫冷冻技术。结果表明:从多种抗冷冻保护液中筛选出的适宜蜜蜂幼虫的冷冻保护液为15%甘油+0.2 mol.L-1蔗糖+0.2 mol.L-1木糖+3%聚乙二醇+15%乙二醇。冷冻剂类为纱布包裹型。冷冻程序:预冷时间为5 min,距液氮高度2~7 cm,降速率为1cm.min-1。解冻液为生理盐水+葡萄糖。此方法冷冻幼虫解冻后成活率为10%左右。     

甘薯茎尖超低温保存技术研究

本试验采用包埋玻璃化法超低温冷冻技术保存徐薯18号的茎尖,结果表明,当剥取茎尖大小为1.0~1.5 mm,玻璃化处理时间为90 min时,茎尖存活率达85%以上。     

马铃薯茎尖超低温保存研究

以马铃薯栽培品种甘农薯1号的试管苗为材料,进行了茎尖超低温保存技术的研究,结果表明,预培养3～4 d,用玻璃化溶液PVS2室温下处理20～30 min,直接投入液氮中冷冻保存,然后接种在MS添加2.50 mg/L KT、1.25 mg/L IAA和1.25 mg/L 6-BA的培养基上,经过恢复培养,茎尖成活率可达42.8%.     

江西山药茎尖包埋玻璃化法超低温保存及其遗传稳定性检测

采用植物组织培养法对广丰药薯茎尖的包埋玻璃化法超低温保存程序进行优化,并采用扩增片段长度多态性（AFLP）分子标记法和流式细胞术对其冻后再生苗的遗传稳定性进行检测,同时将超低温程序应用到江西山药其他地方品种,旨在为薯蓣属植物种质资源的长期保存奠定理论基础。结果表明,广丰药薯茎尖预培养的较佳时间为5 d,较佳的蔗糖浓度为0.75 mol·L-1;装载的较佳时间为40 min;脱水的较佳温度为0 ℃,较佳时间为60 min;冻后黑暗培养7 d可以显著提高其成活率。用AFLP分子标记法和流式细胞术对茎尖冻后再生植株的遗传稳定性进行检测,没有发现异常条带和染色体倍性变化,气孔观察也未发现叶下表皮气孔参数的显著变异。将这种超低温保存程序用于江西山药其他基因型,成活率约为40%～85%。该研究建立的包埋玻璃化法超低温保存程序能保证江西山药的遗传稳定性,可为建立江西山药种质资源超低温保存库提供一定的技术支撑。     

苹果种质资源玻璃化法超低温保存技术

研究了苹果茎的玻璃化法超低温保存技术。实现了低温锻炼、预培养及恢复培养基对成活率的影响，筛选出了合适的冰冻保护剂PVS3，构建了苹果茎玻璃化法超低温保存体系。同时对冻存成活苗的叶片再生能力和过氧化物酶（POD）同工酶进行了检测。     

香石竹茎尖试管苗继代培养玻璃化现象的研究

香石竹红色品种茎尖试管苗继代培养玻璃化现象是香石竹脱毒试管苗生产的一个主要障碍.采用改善光照,在培养中提高糖和琼脂的浓度,降低细胞分裂素的用量,对克服香石竹茎尖试管苗继代培养玻璃化有明显效果,但对一些红色系品种效果并不理想,继代培养玻璃苗率仍达61%以上.     

杂交兰种苗超低温脱毒技术研究

以携带建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的杂交兰根状茎为试材,采用包埋玻璃化超低温保存法对杂交兰病毒脱除进行研究。结果表明：低温炼苗21 d的茎尖,在0.5 mol/L的蔗糖浓度预培养基中培养3 d,然后浸入0.4 mol/L高糖液体培养基中加载90 min,之后转入玻璃化溶液PVS2(protect vitrification solution 2)中冰上处理6 h,再液氮保存1 h,最后于37℃水浴中解冻2~3 min,1.2 mol/L高糖液体培养基中卸载20 min,待恢复培养后,杂交兰茎尖成活率为64%以上,随机检测30个样品,两种病毒脱毒率均为100%。研究为杂交兰种苗脱毒奠定了一定的理论基础。     

满天星试管玻璃化苗与正常苗的比较研究

以满天星组培正常苗和玻璃苗为材料,通过生理生化特性、同工酶分析,探讨了满天星试管苗玻璃化发生原因。结果表明：玻璃苗组织含水量较高,为95.8%,而正常苗为91.7%。玻璃苗的各种叶绿素平均含量及可溶性糖和还原糖含量分别为正常苗的14.0%,63.8%和86.9%;而玻璃苗的过氧化物酶（POD）的活性增加,是正常苗的2.6倍。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对酯酶同工酶进行分析结果表明,玻璃苗的酯酶同工酶电泳谱带出现缺失的异常现象,同时其谱带颜色较浅;过氧化物同工酶电泳结果表明玻璃苗与正常苗相比活性增加且谱带增多。     

Cryopreservation of Queen Honeybee （Apis mellifera carnica） Born Worker Eggs by Vitrification

Many species of insect egg can be targeted individually or （and） collectively for cryopreservation by vitrification. However, there has been no report on cryopreservation of honeybee eggs by vitrification. In an attempt to define a preliminary procedure of cryopreservation of honeybee eggs by vitrification, queen honeybee born worker eggs （worker eggs） were stored through vitrification in liquid nitrogen up to 1 h, and then post-vitrification survival of the vitrified worker eggs in vitro and their hatching rates during maturation in vivo were observed using microscopic and close visual inspections. The procedure of cryopreservation by vitrification included dechorionation with sodium hypochlorite and permeabilization with isopropyl alcohol; equilibration by addition of loading solution （i.e., 25% vitrification storage solution） and dehydration by gradual replacement of loading solution with vitrification storage solution; cooling in liquid nitrogen vapor right before droplet vitrification in liquid nitrogen; and recovery in liquid nitrogen vapor right after storage in liquid nitrogen, thawing at temperature of thawing medium （5% sucrose in TC 100-insect medium） and rehydration by gradual replacement of vitrification storage solution with rehydration solution （5% fetal bovine serum in TC 100-insect medium）. It was found that among the worker eggs experiencing cyropreservation by vitrification, 1.25% of them were successfully passed through the four life stages, viz., egg, larva, pupa, and adult. In summary, it can be inferred that although a majority of worker eggs were dead after cyropreservation by vitrification, a few of them were developed into larvae, pupae, and finally emerged as adults.     

猪卵母细胞冷冻保存研究

【目的】本研究试图通过比较猪卵母细胞超低温冷冻保存方法、冷冻承载工具、冷冻卵母细胞的类型，从而有效地保存猪卵母细胞;【方法】利用屠宰场卵巢采集的卵母细胞，以台盼蓝染色、二乙酸荧光素（FDA）染色鉴定卵母细胞冷冻后的成活率，以体外成熟和体外受精鉴定卵母细胞冷冻后的发育能力，研究了不同冷冻方法和不同冷冻保护剂对猪卵母细胞的冷冻效果。【结果】（1）程序化法冷冻保存中，9%乙二醇（EG），10%二甲基亚砜（DMSO），10%甘油（Gly）均对猪MII期卵母细胞有冷冻保护作用，极显著高于对照组（FDA染色成活率33.8%，25.8%，23.5% vs 2.5%，P <0.01），且以9%EG的效果最好，显著高于另外两组（ 33.8% vs 25.8%，23.5%, P <0.05）。（2）玻璃微细管（GMP）法是猪卵母细胞超低温冷冻的较好方法，以普通的麦管（Straw）法进行的程序化冷冻为对照组，GMP管法显著提高猪卵母细胞的冷冻成活率（分别为63.3%和34.5%，P<0.05）。（3）在玻璃化冷冻方法中，不同的冷冻液载体对猪卵母细胞冷冻成活率有影响。以EFS40为冷冻液，Straw和GMP管作冷冻液载体，卵母细胞的成活率分别为45.0%和65.9%，二者差异显著（P <0.05）。（4）用Straw的程序化冷冻法和用GMP管的玻璃化冷冻法对猪GV期卵母细胞冷冻均有效，但二者差异显著（成活率分别为30.0%和59.7%，P<0.05）。冷冻后继续培养，分别有2.8%和6.3%的卵母细胞周围颗粒层发生扩散。（5）冷冻对MII期卵母细胞的发育潜能影响较大，用新鲜精液使其受精，仅有4.9%的受精卵分裂，极显著低于对照组的49.5%（P<0.01）；发育至4-细胞期的比例为1.7%，但未能发育至8-细胞期以上胚胎。【结论】选用MⅡ期卵母细胞、以GMP管为冷冻承载工具、应用玻璃化冷冻方法能够较好地保存猪卵母细胞，为进一步完善猪卵母细胞超低温冷冻保存技术体系提供了参考依据。     

不同叶菜型甘薯品种茎尖绿原酸含量及清除DPPH·能力

【目的】研究叶菜型甘薯茎尖绿原酸的含量及其清除DPPH·能力,为叶菜型甘薯的品种筛选、栽培及产业化提供理论依据。【方法】在6个不同生长期分别采收广菜薯2号、莆薯53和福薯7-6的茎尖,测定并分析茎尖叶片、叶柄和茎绿原酸含量及其与DPPH·清除能力之间的相关性。【结果】(1)6次采收期的不同甘薯品种茎尖绿原酸平均含量大小为:广菜薯2号(0.2920%fb)莆薯53(0.2750%fb)福薯7-6(0.1638%fb),其中叶片(0.3539%fb)茎(0.1444%fb)叶柄(0.1173%fb),叶片含量是叶柄和茎平均值的2.70倍;广菜薯2号、莆薯53和福薯7-6茎尖前3个采收时期绿原酸的平均含量分别是后3个时期的2.22、2.68和2.41倍,其中叶片、叶柄和茎前3次采收期绿原酸含量的平均值分别是后3次采收期的2.49,2.53和2.20倍。差异均达到显著水平。(2)根据3个品种6次采收期的平均值计算,叶片对茎尖绿原酸含量的贡献率为73.64%,叶柄为11.96%,茎为14.41%。(3)茎尖6次采收期的DPPH·清除能力平均大小为:广菜薯2号(34.99%)莆薯53(31.05%)福薯7-6(18.83%),其中叶片(32.52%)茎(23.64%)叶柄(17.91%);前3个采收时期的茎尖、叶片、茎和叶柄的DPPH·平均清除能力分别是后3个时期的1.91、2.02、1.69和1.99倍。【结论】叶菜型甘薯茎尖绿原酸含量在品种、部位和采收期间有显著差异;DPPH·清除能力与绿原酸含量具有显著或极显著正相关。因此,在叶菜型甘薯品种选育、栽培和产业化过程中要充分考虑茎尖绿原酸含量的变化特点。     

不同冷冻方法对牛体外胚胎ATP含量与ROS水平的影响

【目的】探讨冷冻保存对牛体外生产胚胎能量代谢、有氧代谢造成的影响。【方法】采用常规法或玻璃化法（open pulled straw,OPS法）冷冻保存牛体外受精（in vitro fertilization,IVF）囊胚和体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）囊胚,利用ATP Bioluminescence Assay Kit HS II 和 GENMED ROS Assay Kit检测了冷冻-解冻后囊胚ATP含量和ROS水平。【结果】（1）IVF和SCNT囊胚OPS法冷冻-解冻后存活率（（93.25±5.17）%和（77.56±3.52）%）均显著高于常规冷冻法（（81.25±4.98）%和（49.41±2.24）%）（P＜0.05）;（2）IVF囊胚和SCNT囊胚OPS法冷冻-解冻后ATP含量（（0.63±0.05）和（0.33±0.02）pmol）均显著高于常规冷冻法（（0.45±0.03）和（0.22±0.01）pmol）（P＜0.05）;但是均显著低于相应的IVF或SCNT新鲜囊胚（（0.76±0.04）和（0.40±0.02）pmol）（P＜0.05）;（3）玻璃化冷冻IVF囊胚、SCNT囊胚ROS水平（（74.34±4.24）和（43.21±3.35）cps）高于新鲜IVF囊胚（（48.52±2.65）cps）、SCNT囊胚（（27.36±2.23）cps）（P＜0.05）,常规冷冻组则与此相反（（35.61±4.32）和（16.56±2.52）cps）（P＜0.05）。【结论】玻璃化冷冻较适用于牛IVF、SCNT囊胚冷冻保存;玻璃化冷冻和常规冷冻均显著影响牛IVF囊胚、SCNT囊胚中ATP含量和ROS水平。     

玻璃化法超低温保存香石竹种质资源的研究

以香石竹"云恋蝶"离体茎尖为试材,研究玻璃化法对香石竹茎尖的高体超低温保存.通过正交设计试验对影响存活率的主要因素(预培养培养基中蔗糖浓度、预培养时间、装载时间和PVS2处理时间)进行分析,结果表明,预培养1 d,预培养基中蔗糖浓度为0.5 mol/L,装载40 min,PVS2液处理40 min,液氮处理1 d,在40℃水浴化冻后的香石竹茎尖,成活率达44.13%,且超低温再生苗与其常温苗的生理生化指标无显著差异.本试验成功地建立了香石竹种质资源玻璃化法超低温保存的技术,为香石竹种质资源的长期保存提供了一条有效途径.     

绵羊体外受精囊胚玻璃化冷冻保存的研究

以常规的慢速冷冻法为对照,研究了玻璃化冷冻法保存绵羊体外受精囊胚的效果.对于绵羊体外受精囊胚,两种冷冻方法间的囊胚存活率没有明显差异,但玻璃化冷冻组的囊胚孵化率显著高于慢速冷冻法组(分别为76.8%和41.0%,P＜0.05).将冷冻解冻后的绵羊囊胚移植后,玻璃化冷冻组的怀孕率和产羔率明显高于慢速冷冻法的.同时比较了绵羊体外受精囊胚细胞取样后,经不同时间培养后的玻璃化冷冻保存效果.囊胚取样后培养2 h或5 h,胚胎冷冻解冻后的存活率和孵化囊胚率显著高于对照组(分别为75.0%、50.0%,78.8%、69.7%和41.2%、26.5%,P＜0.05).培养10h后,胚胎冷冻解冻后的存活率和孵化囊胚率有所降低.结果表明,应用玻璃化冷冻法可以较好的冷冻保存绵羊体外受精囊胚及切割取样后的囊胚,绵羊体外受精囊胚切割取样后,经过2～5h时的恢复培养可以提高其抗冻能力.     

兔胚胎玻璃化冷冻的研究

探讨用玻璃化冷冻法保存兔胚胎的效果．结果表明,兔早期囊胚在0．5M海藻糖（93．8％）溶液中的存活率显著高于0．5M蔗糖组（70．0％,P〈0．05）．对照组与不同浓度甘油处理间兔胚胎存活率均差异不显著（P〉0．05）．分别用不同浓度乙二醇玻璃化冷冻兔胚胎,解冻回收后正常胚胎数和囊胚孵化率,对照组与10％,20%EG组之间均差异不显著（P〉0．05）,但对照组,10％,20％EG组均显著高于30％EG组（P〈0．05）．解冻回收后正常胚胎数体内胚胎组（79．4％）显著高于体外胚胎（54．1％,P〈0．05）,囊胚孵化率2组之间差异不显著（P〉0．05）．缓慢冷冻法与玻璃化冷冻法之间胚胎解冻回收后正常胚胎数和囊胚孵化率均差异不显著（P〉0．05）．     

Controlled Freezing and Open-Pulled Straw (OPS) Vitrification of In vitro Produced Bovine Blastocysts Following Analysis of ATP Content and Reactive Oxygen Species (ROS) Level

To our knowledge, no single study has systemically compared cryopreservation efficiencies of bovine blastocysts derived from in vitro fertilization (IVF), intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and somatic cell nuclear transfer (SCNT) by controlled freezing and vitrification. This experiment, therefore, was designed to compare the cryopreservation of these blastocysts with controlled freezing and OPS vitrification. Adenosine-5′-triphosphate (ATP) content and reactive oxygen species (ROS) level in blastocysts were also analyzed. Firstly, for each type of blastocyst (IVF, ICSI or SCNT), significant differences were observed between the survival rates of the controlled freezing ((81.56±2.33), (68.18±4.72) or (47.89±5.83)%) and OPS vitrification groups ((92.24±4.54), (82.40±3.76) or (78.71±5.91)%; P<0.05). Secondly, for each type of blastocyst (IVF, ICSI or SCNT), ATP content was significantly decreased after controlled freezing or vitrification, and the ATP content in the controlled freezing group (0.43±0.06), (0.35±0.05) or (0.21±0.02) pmol) was significantly lower than that found in the OPS vitrification group (0.62±0.04), (0.46±0.03) or (0.30±0.01) pmol; P<0.05). Thirdly, ROS level in fresh IVF ((47.33±3.56) c.p.s (counted photons per second), ICSI ((36.51±2.58) c.p.s) or SCNT blastocysts ((26.44±1.49) c.p.s) was significantly lower than that found in the OPS vitrification group ((72.14±4.31), (58.89±3.89) or (40.11±5.73) c.p.s; P<0.05), but higher than that of the controlled freezing group (34.41±3.32), (23.13±1.26) or (15.46±2.45) c.p.s; P<0.05). The present study indicated that vitrification is more efficient in the cryopreservation of bovine blastocysts derived from IVF, ICSI or SCNT than controlled freezing. Furthermore, both vitrification and controlled freezing significantly altered the ATP content and ROS level in those blastocysts.