单倍体诱导创建二倍体技术在油菜遗传育种中的研究进展

单倍体诱导创建二倍体的技术体系主要包括2种类型。(1)对植物中雄性或者雌性生殖器官进行培养获得具有单套染色体组的组织,经过天然或者加倍剂处理获得二倍体;(2)对CENH3基因进行修饰获得单倍体诱导系,利用单倍体诱导系与不同材料杂交获得后者的单倍体,进而加倍成二倍体。在油菜中应用最广泛的单倍体诱导创建二倍体植株的技术是小孢子培养方法,其过程受到3个因素的影响,分别为小孢子胚发生能力、小孢子天然加倍和加倍剂处理后的加倍效率、从胚再生成完整植株的能力。经过多年研究,在油菜中建立的小孢子诱导创建二倍体的技术为油菜遗传育种研究提供了重要的技术支持。小孢子和小孢子培养得到的胚均能用于创造突变体及遗传转化试验。通过遗传学方法定位了决定油菜小孢子胚发生、天然加倍以及胚状体直接成苗的数量性状基因座(QTLs),可在不同群体中验证候选基因。深入挖掘调控小孢子胚发生和再生成苗的分子机制,分析胚性细胞发育的转变、起始细胞的分化以及胚形态发生的基因调控网络,进而为理解油菜单倍体诱导以及二倍体发生的作用机制提供依据。随着植物单倍体诱导发生的分子机制被逐步揭示,在油菜中对与拟南芥染色体减数分裂相关的同源基因进行修饰能够获得单倍体诱导系,将其与待改良的父母本进行杂交可快速获得具有不同亲本背景的单倍体,经过加倍剂处理可快速获得纯系,单倍体诱导技术能够用于反向育种研究以及品种的遗传改良。     

甘蓝型油菜F1代小孢子的培养方法

游离小孢子具有单倍体核、单细胞和较高同步性等特点，小孢子培养已成为从甘蓝型油菜获得大量单倍体的主要途径。游离小孢子经离体培养和染色体加倍后，能获得纯和的双单倍体植株，小孢子离体培养是加快育种进程的有效方法。本文对游离小孢子离体培养进行了研究，以期对我院油菜育种起到一定的促进作用。     

甘蓝型油菜单倍体植株群体的构建

以油菜双低（低芥酸、低硫苷）品种＂沪油12＂的小孢子来源植株为试验材料,研究了供体植株不同外植体部位不定芽再生情况及影响不定芽诱导的一些因素,并对甘蓝型油菜小孢子来源的再生组培苗进行了染色体倍性的鉴定.结果表明,利用节间茎段进行不定芽诱导是一种较好的快速再生植株方式,具有出芽快,遗传特性保持好的特点.茎段具有较强的不定芽分化能力,而叶柄和叶片难以诱导分化出芽.通过优化培养基,建立了甘蓝型油菜小孢子来源植株茎段高频不定芽再生系统.通过对甘蓝型油菜组培苗的叶片气孔保卫细胞和根尖染色体数目的观察,确定了一批小孢子来源的单倍体植株.     

用气孔保卫细胞周长鉴定甘蓝型油菜植株倍性水平

以甘蓝型油菜小孢子来源的单倍体植株和种子来源的植株为材料，研究两者之间叶片气孔保卫细胞外围周长值（L）的差异，对两者的L值统计分析。结果表明，单倍体植株与种子来源植株之间叶片气孔保卫细胞外围周长值（L）的差异显著，并且在两者第五片叶片中不同部位测得的L值比较稳定，可将L值作为鉴定甘蓝型油菜植株倍性水平的一个辅助指标。     

甘蓝型油菜种质创新的研究与利用

对4个甘蓝型油菜杂交组合F1和白花甘蓝(Brassica oleracea)与双低甘蓝型油菜(B.napus)品种花油3号种间杂交及回交BC4代的植株进行小孢子培养,获得大量的再生植株。通过田间连续的定向选择,结果获得了16份含油量45.19%~50.52%的新种质以及3份双低白花甘蓝型油菜新种质。研究结果表明,应用油菜小孢子培养技术及双单倍体育种技术进行油菜特异种质的创新,是一种快速获得新种质的有效途径,具有较好的应用前景。     

三个油菜F1组合小孢子培养及双单倍体结实性分析

为了研究不同油菜(Brassica napus L.)基因型小孢子培养试验中不同浓度秋水仙碱和氟乐林加倍剂对不同基因型材料小孢子再生、加倍率以及成株结实性的影响,选取3个遗传背景不同的F_1杂交组合,利用秋水仙碱或氟乐林处理小孢子细胞以及对从小孢子直接再生的植株根系进行秋水仙碱浸泡处理,采用流式细胞仪(FCM)检测不同处理方式下小孢子成苗的倍性水平,并对双单倍体植株开展结实性考察分析。结果表明,3个F_1组合的小孢子细胞经过85 mg/L秋水仙碱处理后得到的再生苗数目最多,并且所得到的双单倍体植株的数目最多。不同浓度的氟乐林加倍剂处理试验显示,10μmol/L氟乐林处理小孢子后获得双单倍体相比其他浓度氟乐林处理后的数目多。3个F_1组合的小孢子胚在4℃处理10 d后能够显著提高胚的一次成苗率。对3个F_1组合的小孢子自然加倍和加倍剂处理后获得的DH群体的结实性考察结果显示,自然加倍获得的双单倍体植株的平均角果长、平均每角果粒数和平均千粒重与不同浓度秋水仙碱或者氟乐林处理后获得的双单倍体无显著差异。     

萝卜小孢子植株倍性鉴定研究

以萝卜游离小孢子再生植株为试验材料,采用形态学观察、根尖染色体鉴定、流式细胞测定等方法进行了倍性检测.结果表明,由游离小孢子培养获得的植株中同时含有单倍体、双单倍体和多倍体.来源不同的小孢子培养获得的植株倍性比例不同,不同倍性植株具有不同的形态特征.根尖染色体鉴定是植株倍性鉴定最为准确的方法.流式细胞测定可快速进行倍性测定,且准确率较高.     

芥菜型油菜与白菜种间杂种的获得与鉴定

以芸薹属植物芥菜型油菜和白菜为研究对象,对其进行常规正反杂交后子房的离体培养,通过离体子房培养获得的杂种种子经MS培养基诱导成苗,获得了芥菜型油菜与白菜的杂种F1代植株,表现出杂种优势;通过细胞学的方法,鉴定了杂种F1幼蕾体的细胞染色体数为2n=28,为母本芥菜型油菜(2n=36)和父本白菜(2n=20)的单倍体染色体数之和;芥菜型油菜与白菜常规杂交后,经离体子房培养获得了“胚性芽”,确立了植物胚挽救的另一种形式。     

气孔保卫细胞大小与油菜单倍体及二倍体倍性的相关性研究

对甘蓝型油菜2105品系种子萌发的二倍体植株和小孢子来源再生单倍体植株的不同叶位叶片气孔保卫细胞大小进行了测定,考察了不同叶片的保卫细胞长轴长、短轴长以及其周长差异,并对气孔保卫细胞大小与植株倍性的相关性进行了研究.结果表明:油菜单倍体与二倍体叶片气孔保卫细胞的长轴长、短轴长以及其周长存在显著差异;单倍体和二倍体气孔保卫细胞的周长计算值范围分别为43～59 μm和75～94 μm;相对于单一的长轴长或短轴长观测指标,利用长轴与短轴长度计算的周长值指标对单倍体与二倍体鉴定具有更宽的区分窗口,可用于油菜双单倍体群体构建中植株倍性的快速鉴定.     

甘蓝类蔬菜小孢子再生植株染色体倍性与气孔保卫细胞叶绿体数的相关性

 【目的】研究甘蓝类蔬菜游离小孢子再生植株的染色体倍性与气孔保卫细胞叶绿体数的相关性,为甘蓝类蔬菜提供一种快速、简易、经济、实用而又可靠的倍性鉴定方法。【方法】采用分布型分析和t测验,对结球甘蓝、青花菜和芥蓝不同倍性的小孢子再生植株的气孔保卫细胞叶绿体数进行统计分析。以根尖染色体计数法和田间形态学观察法的倍性鉴定结果,对叶绿体数分界法的可靠性进行验证。【结果】同一倍性植株上的不同叶片间及同一叶片的不同部位间,气孔保卫细胞叶绿体数平均值及变异幅度非常接近。同一小孢子再生植株群体内的不同倍性植株的叶绿体数平均值差异极显著。不同倍性植株间的气孔保卫细胞叶绿体数均呈正态分布。本研究提出了一种根据甘蓝类蔬菜气孔保卫细胞叶绿体数进行染色体倍性鉴定的方法,即气孔保卫细胞叶绿体数≤10的为单倍体,10＜叶绿体数≤15的为二倍体,＞15的为多倍体。该方法经花期形态学观察和根尖染色体计数法验证,其吻合率达93.93%,且此倍性鉴定方法稳定,不受植株生长环境等外界因素影响。【结论】甘蓝类蔬菜游离小孢子再生植株的染色体倍性,可于幼苗期根据气孔叶绿体数目的多少进行鉴定,而且此倍性鉴定方法简单、快捷、经济而又可靠。     

胚珠培养在白菜型油菜和芥蓝远缘杂交中的应用

以3个白菜型油菜材料为父本、3个芥蓝材料为母本,进行人工远缘杂交,探讨甘蓝型油菜种质资源的人工合成与创新。结果表明:对授粉2周后的胚珠进行离体培养,获得远缘杂交的异源单倍体植株。对单倍体植株进行秋水仙素泡根处理诱导染色体加倍,经流式细胞仪倍性鉴定和植株田间表型观察,获得3个远缘杂交组合的4个异源单倍体和异源四倍体杂交后代。芥蓝与白菜型油菜远缘杂交具有一定的亲和性,杂交后代植株的许多性状介于亲本之间,营养生长旺盛,植株长势明显强于双亲,分枝增多,可为甘蓝型油菜育种提供优异的亲本材料和种质资源。本研究对于利用白菜型油菜和芥蓝进行甘蓝型油菜新种质创制具有一定参考价值。     

甘蓝型油菜基因型对离体小孢子染色体加倍的反应

采用秋水仙碱处理甘蓝型油菜不同基因型的离体小孢子,研究了小孢子再生植株的染色体加倍特性 及其与基因型的关系。将发育到单核晚期一双核早期的小孢子分别接种于含10、20、50、100 mg／L秋水仙碱的 NLN液体培养基中处理24 h或48 h进行染色体加倍,然后将处理过的小孢子转接于不含秋水仙碱的相同培 养基中诱导胚状体。21种基因型小孢子再生植株中双单倍体比率为23．94％～99．42％。方差分析的结果表 明,基因型相似的品系和杂种之间染色体加倍率差异不显著,基因型不同的一些品系和杂种间差异显著。由 此说明,基因型对秋水仙碱处理离体小孢子诱导染色体加倍的反应不同。     

甘蓝类植物游离小孢子培养研究进展

近年来,单倍体育种得到迅速发展。游离小孢子培养是产生单倍体的有效途径。对影响甘蓝类植物游离小孢子培养的主要因素———材料的基因型、小孢子发育时期、培养条件、培养技术及胚状体发生和植株再生等研究情况进行综述,为进一步应用小孢子培养技术提供借鉴。     

小麦与玉米杂交诱导单倍体技术的应用与研究进展

小麦与玉米杂交诱导单倍体技术发展迅速,1988年英国Laurie等首次获得了小麦×玉米产生的单倍体植株,Inagaki（1990）和孙敬三（1992）也相继获得小麦×玉米杂交的单倍体植株。目前,该方法已发展成产生小麦单倍体的重要途径。     

青花菜单倍体育种研究进展

 通过小孢子培养或花药培养获得双单倍体（DH系）是青花菜育种的一个重要辅助手段。回顾了青花菜单倍体育种的发展历史及现状,阐述了青花菜花药培养技术、游离小孢子培养技术及影响植株再生的主要因素,比较了不同培养途径再生植株倍性表现差异和几种主要的倍性鉴定方法,探讨了单倍体和DH系在基础研究和育种实践中的应用现状和应用价值,提出了这一领域存在的问题,并展望了单倍体育种在研究和生产实践中的应用前景。     

萝卜游离小孢子培养及胚再生植株研究

[目的]探讨在自然生长条件下若干因素对萝卜（RaphanussativusL．）小孢子胚诱导及胚再生植株的影响。[方法]首先探讨不同萝卜品种的出胚能力,然后分析热激、低温预处理和培养基对小孢子培养的影响,最后研究胚状体再生成苗与植株继代培养情况。[结果]对22份萝卜材料进行游离小孢子培养,12份获得胚状体,3份获得再生植株,出胚材料中90％以上为杂种一代。4℃低温预处理0～3d小孢子出胚率无明显差异;培养基中加入1～2滴0．5％活性炭和一定浓度6-BA可显著促进小孢子诱导产生胚;不同萝卜品种适宜的热激温度和时间有所不同;发育正常的子叶型胚成苗率为100％;胚萌发分化早期适宜培养基为B5＋2％蔗糖＋1．2％琼脂,后期可逐渐将琼脂浓度降低;FCM测定小孢子植株自然加倍率为30％,单倍体占少数,四倍体与嵌合体（二、四倍）均为30％;秋水仙素处理单倍体植株,人工加倍率达60％。[结论]该研究完善了萝卜游离小孢子培养技术,可提高单倍体获得频率,加快这一技术在育种实践中的应用步伐。     

大白菜游离小孢子培养技术研究进展

近年来,单倍体育种得到很大的发展,游离小孢子培养技术是产生单倍体的较好途径。阐述了大白菜游离小孢子培养技术的发展历史及现状,探讨了大白菜游离小孢子胚胎发生及植株再生的主要影响因素,展望了这项技术在研究和生产实践中的应用前景,并提出了这一领域内存在的问题。     

油菜小孢子培养技术体系研究

小孢子培养在油菜的基础研究和应用研究中均具有十分重要的意义。自1982年Lichter首 在甘蓝型油菜中进行小孢子培养获得成功以来,国内外在油菜小孢子培养技术方面已取得大量研 成果,包括油菜小孢子胚状体发生的影响因素,小孢子植株的再生、成苗、大田移栽、染色体加倍等 近年来又对一些关键技术环节加以了改进,笔者在对这些研究成果进行总结的基础上针对中国国 建立了大田条件下油菜高效小孢子培养技术体系。用该体系对甘蓝型油菜和新疆野生油菜的体细 杂种后代进行小孢子培养的出胚率达到300枚/皿以上,采用小孢子苗直接移栽大田技术,成活率 到89．0％。此外还成功构建了含127个DH系的黄籽油菜DH群体及含115个DH系的粒重分 离 体。     

秋水仙碱处理油菜离体小孢子的染色体加倍效应

用秋水仙碱对52份甘蓝型油菜品系（种）和它们的杂种离体小孢子的单倍体二倍化技术进行了研究。从花药中分离出的单核晚期小孢子接种在含10－800mg/L秋水仙碱的NLN液体培养基中处理16－90h后转入无秋水仙碱的相同培养基诱导胚状体。结果表明，用10mg/L秋水仙碱处理小孢子48h，10份材料的双单倍体植株变幅为37.10%-90.12%，平均为65.44%。50mg/L处理48h的8份材料是48.72%-97.81%，平均88.86%。100－800mg/L处理16－48h的试验，多数加倍率在90％－100％之间。但该处理药用量大，费用高，而且对小孢子毒性大，胚状体再生率低。试验还表明，秋水仙碱处理小孢子诱导的二倍体植株所产生的花一般均能结籽，带有不孕花的嵌合植株极少。用秋水碱处理水孢子再生的植株的根或芽所产生的二倍体植株多是可孕和不孕花共生的嵌合植株，自交后产生的单株种子很少，难以达到遗传和育种所需的群体量。     

芸薹属蔬菜游离小孢子培养研究进展

芸薹属蔬菜种质资源丰富,是中国蔬菜产业的重要组成部分。游离小孢子培养是创造单倍体和双单倍体的重要途径,对提高芸薹属蔬菜的育种效率具有重要意义。为了研究芸薹属蔬菜游离小孢子的高效培养体系,归纳了植物材料、预处理方式、培养基成分、培养密度、高温热激、植株再生、植株的倍性鉴定与加倍等多个因素对小孢子培养的影响,提出了可通过优化培养体系、遗传转化和共培养等方式提高芸薹属蔬菜小孢子培养效率的观点。