鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定

对武汉周边地区的病鸭进行了病理剖检及细菌分离培养，并对分离的菌株进行了生化鉴定，最后确定此病为鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）引起的。感染鸭为2～6周龄，RA易在病死鸭的肝脏、脾脏、血液等处分离到，特别是在脑组织中极易分离。该分离菌株的血清型鉴定结果为Ⅰ型RA,药敏试验结果显示对诺氟沙星高度敏感。     

基于鸭疫里默氏杆菌16SrRNA PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中鸭疫里默氏杆菌(RA)16SrRNA基因序列设计特异性引物,建立了基于鸭疫里默氏杆菌16SrRNA PCR检测方法。以建立的PCR方法对RA、大肠杆菌、沙门氏菌、鸭源金黄色葡萄球菌、两双歧杆菌、短乳酸杆菌、屎肠球菌和短小芽孢杆菌进行检测,结果只有RA DNA能扩增出844 bp的特异条带,其他细菌的DNA不能扩增出任何条带;从凝胶中回收DNA条带,测序结果与GenBank中RA相应序列完全一致。对不同稀释度的RADNA样品进行扩增,PCR对RA DNA最小检出量为22 pg,最少检出RA 80 CFU/mL。以该PCR方法对可疑为RA的临床病料和菌株进行检测和鉴定,结果与细菌分离鉴定吻合率为100%。表明本研究所建立的基于RA 16SrRNAPCR方法具有快速、灵敏、特异的优点,可用于RA感染的检测、分子流行病学调查和分离菌株的快速鉴定。     

鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药性研究

为了解广西鸭疫里默氏杆菌病的发病情况、流行血清型及其病原菌株的耐药情况,从广西不同地区20多个发病鸭场的病料中分离出36株疑似鸭疫里默氏杆菌（RA）,经细菌培养特性、形态特征、生理生化特性鉴定,确定为RA。采用玻片凝集试验和试管凝集试验进行血清型鉴定,结果表明,广西RA分属于1型、2型和3型3个血清型。药敏试验结果表明,有70.0%以上RA分离株对头孢三嗪、先锋霉素V、头孢西丁、头孢拉定、呋喃妥因、氟苯尼考等6种抗生素高度敏感,但所有分离株对23种抗生素均存在耐药性,其中对强力霉素、庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那的耐药菌株比例达到100.0%。     

鸭疫里氏杆菌RA JS01菌株的PCR鉴定及生物学特性

在临床疑似鸭传染性浆膜炎的病鸭组织中分离了1株RA JS01菌株,通过形态观察、生化试验和PCR鉴定,确定该菌株为鸭疫里氏杆菌,结果表明:该菌株对多数抗生素都具有耐药性和较强的致病性;经静脉和足底接种的鸭在接种后24 h时开始死亡,接种96 h时全部死亡;连续传至22代时菌株的生物学特性均未发生变化。     

PCR法快速检测鸭疫里氏杆菌的研究

根据Gen-Bank中25株鸭疫里氏杆菌(RA)的外膜蛋白A(OmpA)基因序列,在其高度保守区设计了一对特异性引物,成功地建立了鸭疫里氏杆菌的快速、准确PCR检测方法。RA参考菌株J04(2型)、J07(JX1型)均能扩增出67lbp的特异性目的条带,而对鸭源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌、鸭源葡萄球菌的扩增结果均为阴性。PCR产物经EcoRI酶切鉴定得494bp和177bp两个预期条带。最低检出基因组DNA浓度为800fg。用全菌体进行PCR时,本实验室分离鉴定的60株RA均能够扩增出特异性目的条带。25份临床疑似病例的分离菌株的PCR扩增阳性率与生化鉴定率完全一致。该方法表明能从痫料组织培养8h的混合菌群中快速、准确地检测到RA,可用于RA的快速诊断和流行病学调查。     

14株鸭疫里默氏杆菌的部分生物学特性分析

为了解鸭疫里默氏杆菌的流行情况,对信阳地区疑似鸭疫里默氏杆菌感染病料进行病原分离和鉴定。结果显示,共鉴定到14株鸭疫里默氏杆菌,其中血清1型、2型和10型菌株依次为3、4、2株,未定血清型菌株5株;动物致病性试验结果显示,分离菌对雏鸭均具有致病性。对11种抗菌药物敏感性检测结果表明,分离菌株对阿米卡星、链霉素和头孢曲松较为敏感,对氟苯尼考、阿莫西林、磺胺异■唑、多黏菌素B和多西环素耐药性较高;生物被膜检测结果表明,14株菌株中有8株为强生物被膜形成株,2株为弱生物被膜形成株。     

鹅源2型鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

[目的]确诊以肝包炎、心包炎、气囊炎为特征的鹅病,分离鉴定致病菌和血清型,并筛选敏感药物。[方法]无菌采集病鹅心血、肝脏、脾脏等病料,分离菌株,进行了病原分离鉴定、血清型鉴定、动物回归试验及药敏试验。[结果]通过对分离菌株鉴定,确诊为鸭疫里氏杆菌感染,血清型为2型,且对头孢曲松、复方新诺明、头孢噻呋高度敏感。[结论]2型鸭疫里氏杆菌与多种致病菌引起的症状相似,只有通过实验室分离鉴定才能确诊,临床可选用头孢曲松、复方新诺明等敏感药物来防治该病。     

4株鸭疫里默氏杆菌的PCR快速鉴定及药敏试验

从湖北省武汉郊区和监利市两地的发病雏鸭分离纯化到4株鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA),通过对该菌形态学鉴定、生化试验、细菌16S rRNA的快速鉴别诊断证明了4株细菌均为鸭疫里默氏杆菌.将不同来源的菌株各选一株HBSPX和HBJL,进行了16S rRNA目的片段的扩增并测序,测序结果表明这两株细菌与其他鸭疫里默氏杆菌的16S rRNA同源性高达99.4％和98.9％.药敏试验结果表明,HBSPX株对阿莫西林、先锋Ⅵ高度敏感,但HBJL株对氯洁霉素和红霉素高度敏感.     

百色市鸭疫里默氏杆菌病的流行病学及其病原的分离与鉴定

2006年5月～2007年3月间，对百色市所辖12个县（区）的86个养鸭场（户）多个品种的鸭群进行鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer—RA）病发生和流行情况的调查。结果从186羽具有浆膜炎病变的死鸭及其同群病鸭的肝和脑中分离到62株RA可疑菌株，通过生化试验证明它们基本符合RA的特征；应用建立的PCR技术均可从这些菌株扩增到RA的特异性基因片断；通过与阳性血清所做的玻片凝集试验证明．分离出的RA菌株全部属于血清1；在鸭疫里默氏杆菌阳性病料中，RA单一感染的占25．81％（16／62）、RA与大肠杆菌混合感染率56，45％（35／62）、RA与沙门氏杆菌混合感染率17．74％（11／62）；病例中大肠杆菌单独感染占6．99％（13／186）；2～5周龄雏鸭最易感染，北京鸭最易感染；药敏试验表明，大多数RA分离株对头孢类药物表现高敏，但总体上耐药性比较严重；分离株的致病性试验结果显示，RA的致病力比较强．与大肠杆菌的混合感染的致病力更强。本研究证明鸭疫里默氏杆菌病已成为百色肉鸭养殖业最常见的、危害最大的传染病之一。     

鸭源大肠杆菌O_(88)的分离鉴定及药敏试验

为了分离鸭大肠杆菌病病原,并筛选出敏感药物,从河北省安新县某大型鸭场30日龄病死雏鸭肝脏分离到一株革兰氏阴性杆菌,通过菌落形态观察、培养特性试验和生化试验鉴定以及药敏试验。确定为大肠杆菌。应用大肠埃希菌O抗原定型血清鉴定为O_(88)。动物试验结果显示,该分离菌株对小鼠有较强的致死性,为致病性大肠杆菌。药敏试验结果显示,分离菌株对庆大霉素、头孢曲松、头孢拉啶、呋喃妥因等药物敏感,对氨苄西林和链霉素等产生耐药。     

用抑制性差减杂交筛选鸭疫里氏杆菌2型可能毒力基因

为寻找鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)可能的毒力基因,以鸭疫里氏杆菌2型(RA2)毒力株RAF2及弱毒力株LY-58为研究对象,通过抑制性差减杂交(SSH)试验,从RAF2株中获得14个特异性差异基因片段。经同源性分析,其中6个差异基因片段分别与外膜蛋白、ATP结合蛋白、转录调节因子、氨基酸通透酶、胞外蛋白编码基因有同源性,为可能的毒力基因;4个差异基因片段与功能未知蛋白或假定蛋白编码基因有关;另外4个差异基因片段未找到同源序列。利用PCR对上述10个可能与毒力相关的差异基因片段在13株分别属于8个不同血清型RA中的分布进行了检测,结果表明除8型外,以上差异基因片段在RA中分布普遍。     

鸭疫里默氏杆菌原生质体制备与再生的研究

以耐药标记的鸭疫里默氏杆菌TXRAl(CAd ,Elf)为亲本菌株,在DNase I始终存在的条件下,采用Lysozyme-EDTA法制备原生质体,然后在高渗琼脂平板上再生。系统地优化了影响原生质体制备及再生的各种条件,摸索出鸭疫里默氏杆菌TXRA1以Lysozyme 0．1 g／L作用20 min后补加EDTA至终浓度为0．01 mol／L继续作用45 min为最佳试验条件,并成功获得了92％的原生质体制备率和38．77％的再生率。     

鸭疫里默氏菌对氟喹诺酮药物的主动外排作用

为研究鸭疫里默氏菌对诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等氟喹诺酮类药物的主动外排机制,测定25株鸭疫里默氏菌临床分离株对氟喹诺酮类药物的最低抑菌浓度（M IC ）,同时测定加入主动外排抑制剂碳酰氰间氯苯腙（CCCP）后的MIC ,对二者进行比较分析。结果表明,对5种氟喹诺酮类药物耐药的鸭疫里默氏菌比例分别为84％、72％、76％、68％和36％;76％的菌株同时耐受2种及以上药物。CCCP可以使耐药菌对除左氧氟沙星外药物的敏感性增加,提示主动外排在鸭疫里默氏菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制中发挥重要的作用。     

鸭疫里默氏杆菌的分离、鉴定及防治研究

本研究首次从病原学角度证实了鸭疫里默氏杆菌病在河北省的存在。在1999年底,河北省中南部地区部分肉鸭饲养场的幼龄鸭发生了一种传染病,经流行病学调查,临床观察,病理剖检,病原的分离和鉴定确诊为鸭疫里默氏杆菌病,分离菌经凝集试验和琼脂扩散试验鉴定为鸭疫里默氏杆菌血清Ⅰ型,易感雏鸭接种试验能够复制出典型的病例,通过药敏试验选择敏感药物,有效地控制了疫情。     

鸭疫里默氏杆菌PCR快速检测方法的建立

鸭疫里默氏杆菌病对养鸭业危害严重,传统及常规检测方法均有不足,因此有必要建立起一种更加快速简捷、敏感实用的菌落PCR法。根据GenBank公布的鸭疫里默氏杆菌ATCC株OMPA基因序列,在基因保守区设计特异性引物,直接挑取单菌落作为模板,从分离鉴定的1,2,10,11型15株菌及1,2,10,11型4株参考菌株中均能扩增出大小为670 bp的特异性核酸片段,而对照的大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性;将培养菌用TE作10倍梯度稀释,最低检出限量为80个鸭疫里默氏杆菌;建立的菌落PCR与常规PCR法比较,两种方法均能扩增出相同的特异性条带。结果表明,菌落PCR法具有较好的特异性和敏感性,与常规PCR法结果完全一致,且更加快速简捷,在临床应用上具有更好的实用价值。     

中药双炎散治疗鸭疫里默氏杆菌病的研究

[目的]为寻求能防治鸭疫里默氏杆菌病的中药,减少抗生素残留奠定基础。[方法]从某养鸭场出现典型病变的病死鸭分离到3株鸭疫里默氏杆菌,探讨中药制剂双炎散对鸭疫里默氏杆菌病的防治效果,并将其与氟甲砜霉素的防治效果进行了比较。[结果]双炎散对鸭疫里默氏杆菌具有显著的治疗和预防作用。对感染里默氏杆菌的雏鸭的有效治疗率为82.5%,与氟甲砜霉素无明显的差异(P>0.05)。双炎散对发病雏鸭的治疗效果与氟甲砜霉素无明显的差异(P>0.05)。双炎散发挥药效的时间较晚,但其治疗效果却稍好于氟甲砜霉素。[结论]双炎散制剂在防治鸭疫里默氏杆菌病中具有广泛的应用前景。     

鹅鸭疫里默氏杆菌感染的诊断与治疗

2006年5月,海安县某养鹅大户所养肉鹅出现急性死亡。患病鹅的临诊症状、病理变化符合鸭疫里默氏杆菌感染的特点。通过细菌的分离培养获得了1株细菌的纯培养物;涂片染色镜检、血清学试验、动物试验的结果表明所分离的细菌为1型鸭疫里默氏杆菌。选用23种抗生素进行药敏试验,确定所分离的鸭疫里默氏杆菌对羟氨苄青霉素、林可霉素高度敏感,对头孢拉定、头孢氨苄、强力霉素和环丙沙星中度敏感,对其他药物低敏或耐药。选择高敏药物进行治疗,并结合消毒以及紧急免疫接种,有效地控制了疫情的发展和传播。     

1型和2型鸭疫里默氏菌的交叉保护

通过PCR扩增、克隆、序列测定获得29株鸭疫里默氏菌(RA)的16S rRNA和16S-23S rRNA间隔区的核苷酸序列.将16S rRNA和16S-23S rRNA间隔区序列连接后分析发现,1型菌株和大多数2型菌株分别处于不同的分支,而2型菌株中的RAf11、RAf3和RAf104不处在2型菌株的分支中,却与1型菌株非常接近.挑选RAf11菌株和2型分支中的RAf19菌株,分别制备灭活苗,免疫雏鸭后进行攻菌保护试验,RAf11菌株对1型菌株的攻击可产生较高的交叉保护率,达53.8%,而RAf19菌株对1型菌株攻击的保护率仅为23.1%.借助16S rRNA和16S-23S rRNA间隔区序列的分析,筛选到一株具交叉保护的RA菌株.