环丙氨嗪人工抗原的合成与鉴定

本研究拟通过抗原合成、多克隆抗体制备等途径建立快速的环丙氨嗪酶联免疫检测方法.主要采用戊二醛桥连法,偶联半抗原环丙氨嗪和载体牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA),制备酶联检测的免疫抗原和包被抗原.经紫外光谱和气相-傅里叶-红外光谱鉴定,在紫外265 nm波长处得到环丙氨嗪-BSA吸收峰;在红外3 350～3 300 cm-1、1 660～1 500 cm-1和1 695～1 665 cm-1波长处分别得到环丙氨嗪-BSA和环丙氨嗪-OVA特征性偶联吸收峰,证实本试验人工合成的2对抗原均偶联成功.免疫抗原和包被抗原的偶联比分别达到25.9 ∶ 1、23.1 ∶ 1,为进一步制备抗血清和酶联检测方法的建立奠定了工作基础.     

红景天苷人工抗原的合成与鉴定

合成红景天苷人工抗原,为进一步建立免疫学分析方法提供依据,采用高碘酸钠氧化法分别将红景天苷(Salidroside)、牛血清蛋白(BSA)与卵白蛋白(OVA)人工偶联成免疫抗原(SAL-BSA)和包被抗原(SAL-OVA),并利用紫外光谱法、SDS-PAGE法鉴定。用制备的人工免疫抗原免疫小鼠,用间接酶联免疫法测定抗体效价。结果成功制备了SAL-BSA、SAL-OVA两种抗原,SAL-BSA偶联比可达到7∶1,在免疫后的小鼠血清中检出了抗红景天苷的抗体,效价为1∶4 000。成功合成红景天苷人工抗原,为下一步单克隆抗体的制备及建立相应的免疫学分析方法奠定了基础。     

西维因人工抗原的合成与鉴定

[目的]制备西维因农药小分子的抗体,为建立免疫分析方法提供保障。[方法]制备6-(1-萘氧基甲酰胺基)己酸及其活化酯,将其与生物大分子偶联得到人工免疫抗原和包被抗原。[结果]通过对CNH及其活化酯的偶联物进行质谱、核磁共振、红外线鉴定,证实合成的产物为目标人工标原。[结论]成功制备了西维因人工抗原,为西维因农药残留免疫分析的方法研究奠定了基础。     

伏马菌素B_1人工抗原的鉴定及抗体的制备

采用戊二醛(GA)一步法将半抗原伏马菌素B1(FB1)分别与鸡卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备2种具有免疫原性的FB1人工抗原FB1-OVA和FB1-BSA。分别采用凝胶电泳法、紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、基质辅助激光分析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)4种方法鉴定人工抗原偶联效果并测定偶联比。将FB1-BSA作为免疫抗原免疫BALB/c小鼠,FB1-OVA作为固相包被抗原,采用间接酶联免疫吸附法(i-ELISA)测定小鼠抗血清滴度。结果表明:4种方法均鉴定FB1人工抗原合成成功。凝胶电泳法测定FB1-OVA和FB1-BSA相对分子质量分别约为50 000和75 000。MALDI-TOF-MS测定FB1-OVA和FB1-BSA相对分子质量分别为48 009.212和74 355.301,并精确计算FB1-OVA和FB1-BSA偶联比分别为5∶1和10∶1。FB1-BSA免疫后小鼠的抗血清效价为1∶1.25×105,并具有较高灵敏度。     

抗双酚A多克隆抗体的制备

[目的]制备可以识别双酚A（BPA）的多克隆抗体。[方法]通过双酚酸（DPA）与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）以及卵清白蛋白（OVA）偶联制备免疫抗原DPA-BSA和包被抗原DPA-OVA,以DPA-BSA免疫新西兰大白兔获得抗血清,并采用间接竞争酶联免疫吸附（ELISA）检测方法对抗体进行鉴定。[结果]经紫外光谱分析,DPA-BSA和DPA-OVA制备成功。抗血清效价最高达到1∶256 000,50%抑制率（IC50）达17.2 ng/ml。[结论]该研究为建立双酚A的快速筛选方法奠定了基础。     

丙烯酰胺人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

摘 要：利用偶联方法合成丙烯酰胺人工抗原,通过免疫方法获得抗丙烯酰胺多克隆抗体;应用戊二醛法将丙烯酰胺与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,并对这两种物质及其复合物进行紫外扫描,并用此复合物免疫兔子,利用间接酶联免疫吸附法测定抗体的效价;应用牛血清白蛋白与丙烯酰胺偶联人工抗体成功,抗体效价大于8100;应用人工抗原免疫成功制备抗丙烯酰胺多克隆抗体。     

百菌清人工抗原的合成及多克隆抗血清的制备

将百菌清(CTN)进行化学修饰后引入羟基活性基团,合成具有半抗原结构特征的百菌清衍生物(CTN-OH);采用N,N-羰基二咪唑法(CDI)将CTN-OH与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联合成人工免疫抗原CTN-BSA和包被抗原CTN-OVA,用紫外分光光度法(UV)和凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定;通过动物免疫试验获得鼠源多抗血清,并使用间接ELISA和阻断ELISA的方法对多抗血清进行鉴定。结果表明,半抗原CTN-OH与载体蛋白偶联成功;受免3只小鼠的效价均达1∶12 800,且2号小鼠对CTN的IC50为93.593μg/L,成功获得高效价、高敏感性、特异性强的鼠源多克隆抗血清,为CTN单克隆抗体制备及快速检测方法的建立奠定基础。     

己烯雌酚人工抗原的合成和酶免疫检测方法的建立

通过化学方法合成己烯雌酚单羧甲基醚,并通过核磁共振和质谱进行鉴定;分别用混合酸酐法和碳二亚胺法将其与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,合成己烯雌酚人工抗原,经紫外扫描、聚丙烯酰胺凝胶电泳和动物免疫试验证实人工抗原合成成功,并制备了抗己烯雌酚的特异性多克隆抗体,同时建立了己烯雌酚的酶免疫检测方法,这对动物性食品中己烯雌酚的残留检测有重要意义。     

溴氰菊酯人工抗原的合成及偶联比的测定

溴氰菊酯农药分子的人工抗原合成是酶联免疫分析技术的关键,利用重氮化法将合成的溴氰菊酯半抗原(±)α-氰基对氨基苯氧基苄基(1R,3R)-2,2-二甲基-3-(2,2-二溴乙烯基)环丙烷羧酸酯分别偶联到牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)上制得两种人工抗原。合成的两种溴氰菊酯人工抗原用于动物免疫及免疫后抗体的检测,测得它们的偶联比分别为6∶1和7∶1。     

氯羟吡啶人工抗原的合成及抗体特性

研究氯羟吡啶(CLOP)人工抗原合成及其多克隆抗体(pAb)制备。将CLOP进行化学修饰引入活性基团羧基,合成氯羟吡啶半抗原(CLOP-2C);分别采用活泼酯法和混合酸酐法将CLOP-2C与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工免疫原CLOP-2C-BSA和包被抗原CLOP-2C-OVA,用紫外(UV)和凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定;用CLOP-2C-BSA免疫Balb/c小鼠,间接ELISA测定CLOP pAb效价,阻断ELISA鉴定其敏感性,交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明:CLOP-2C-BSA偶联成功,CLOP-2C与BSA的分子结合比为34.0∶1;CLOP pAb效价达到1∶(2.56×104),对CLOP的IC50为7.76μg/L,与其他抗球虫药的交叉反应率低,获得高价、敏感、特异的CLOP pAb,为CLOP残留免疫学检测方法的建立奠定基础。     

抗DDA抗体的制备及其特性研究

制备抗DDA抗体,建立间接竞争酶联免疫吸附实验(Indrect Competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assay,idc-ELISA)方法,以测定海水样品和海洋贝类中的有机氯农药滴滴涕(DDT)代谢产物.采用碳二亚胺法,将半抗原DDA分别与载体蛋白牛血清白蛋白(Bovine semm albumin,BSA)和卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)偶联,得到完全抗原.以DDA-BSA为抗原,免疫BALB/c小鼠,制备抗DDA抗体.研究表明,5只鼠产生的抗体对DDA都能产生灵敏的特异性免疫反应,以DDA-OVA为包被抗原,用5#抗体建立间接竞争ELISA方法检测海水样品和海洋贝类中的有机氯农药DDT代谢产物DDA,最低检出限为:10.0 ng·mL-1,海水加标样平均回收率122%,批间变异系数30%,贝类加标样平均回收率为131%,批间变异系数22%.     

四环素全抗原的合成及多克隆抗体的制备

利用Mannich反应合成四环素(Tc)与BSA(牛血清白蛋白)的完全抗原,由紫外光谱确定是否偶联成功;同理,制备四环素OVA抗原作为包被抗原,以制备的完全抗原TC-BSA免疫清洁级新西兰兔制备多克隆抗体,运用间接ELISA法测定血清抗体效价。试验结果表明,紫外光谱确定偶联成功,血清抗体效价为105,间接竞争法测定抗体50%抑制率(IC50)检测限为200ng/mL,最低检测限量可达到20ng/mL,特异性好。     

培氟沙星人工抗原的合成与鉴定

【目的】制备培氟沙星(Pefloxacin,PEF)完全抗原,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】以培氟沙星与牛血清白蛋白(BSA)为材料,用碳二亚胺(EDC)法制备培氟沙星-牛血清白蛋白完全抗原(PEF-BSA),变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及紫外扫描(UV)检测其免疫学特性;利用PEF-BSA免疫BALB/c小鼠,无菌条件下收集血清,用间接ELISA测定多抗血清(pAb)效价。并用同样的方法制备和鉴定培氟沙星-鸡卵清白蛋白完全抗原(PEF-OVA)。【结果】培氟沙星与牛血清白蛋白及鸡卵清白蛋白偶联成功,PEF-BSA偶联比为8∶1,PEF-OVA偶联比为6∶1。间接ELISA测得多抗血清效价均达到4 000以上,得到了较好的免疫效果。【结论】成功得到了培氟沙星完全抗原,该抗原具有较强的特异性及良好的敏感性。     

基于特异性对硫磷单克隆抗体的间接竞争酶联免疫吸附分析方法建立

[目的]制备特异性识别对硫磷(PA)的单克隆抗体,建立其间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA),为实现对硫磷的农残快检提供技术支持.[方法]以化合物4-(二乙氧基硫代磷酸酯基)苯甲酸为半抗原,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备人工抗原,免疫7周龄Balb/c雌性小鼠,取抗血清效价最高、特异性最优小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,采用间接酶联免疫方法(i-ELISA)及ic-ELISA分别评价融合细胞株的阳性和特异性,通过有限稀释法筛选稳定分泌对硫磷抗体的单克隆细胞株.再通过棋盘格试验筛选出抗原抗体最佳工作浓度组合建立对硫磷ic-ELISA标准曲线,并基于对硫磷单克隆抗体与各结构类似物的交叉反应率,评估ic-ELISA的特异性.采购西红柿样品进行对硫磷的添加回收试验,运用气相色谱法(GC)验证ic-ELISA的准确性.[结果]成功合成对硫磷人工抗原PA-BSA和PA-OVA,经5次免疫后融合小鼠的血清效价为8×103;通过有限稀释法筛选获得灵敏度高、特异性最强的对硫磷单克隆细胞株4F11A10.以2μg/mL包被抗原PA-OVA、0.25μg/mL细胞株4F11A10分泌抗体为最佳抗原抗体工作浓度组合,建立对硫磷ic-ELISA及其标准曲线,其半抑制浓度(IC50)为50 ng/mL,检测范围(IC20~IC80)为2.34~300 ng/mL;所建立的对硫磷ic-ELISA与5种有机磷农药(丙溴磷、杀扑磷、倍硫磷、水胺硫磷和甲拌磷)均无交叉反应.对比ic-ELISA和GC测定西红柿样品中对硫磷的添加回收试验结果,发现ic-ELISA的添加回收率为84.86%~100.27%,GC的添加回收率为97.60%~106.40%,两种方法的检测结果一致性较好.[结论]建立的ic-ELISA可用于快速检测蔬菜、水果等农产品中的对硫磷残留.     

氟苯尼考人工抗原的合成与鉴定

采用混合酸酐(MA)法,将氟苯尼考(FFC)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)连接,制备人工免疫抗原FFC-HS-BSA和包被原FFC-HS-OVA,经紫外扫描(UV)、凝胶电泳 (SDS-PAGE)、红外扫描光谱(IR)和动物免疫试验证实人工抗原合成成功.     

泰妙菌素完全抗原制备及鉴定

为建立泰妙菌素(Tiamulin,TML)完全抗原制备方法,分别用混合酸酐法(Mixed anhydride,MA)和N,N-羰基二咪唑法(1,1′-Carbonyldiimidazole,CDI)将半抗原泰妙菌素偶联至载体牛血清白蛋白(Bovine serum albumen,BSA),以制备泰妙菌素完全抗原。对2种方法制备的抗原进行紫外扫描鉴定和SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,根据SDS-PAGE凝胶电泳图估算出完全抗原的偶联比。结果均显示抗原偶联成功,估算出的偶联比分别约为1∶23.6和1∶8.1,说明,混合酸酐法制备泰妙菌素完全抗原时偶联率更高。     

巴氯芬人工抗原的合成及其鼠源多克隆抗体的制备

【目的】合成巴氯芬（baclofen,BA）人工抗原并制备其多克隆抗体,为巴氯芬免疫学快速检测方法的建立奠定基础。【方法】采用碳二亚胺（EDC）法将BA分别与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清白蛋白（OVA）偶联,合成免疫抗原BA-BSA和包被抗原BA-OVA,通过紫外扫描和SDS PAGE凝胶电泳鉴定其偶联效果。将免疫抗原BA-BSA免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA、间接竞争ELISA及交叉反应试验分别对所获多克隆抗体的效价、敏感性、特异性等免疫学特性进行鉴定。【结果】紫外扫描和SDS-PAGE凝胶电泳结果表明人工抗原偶联效果良好。ELISA结果表明,多克隆抗体的效价达到1∶256 00,半数抑制浓度（IC₅₀）为22.33 ng/mL,且与巴氯芬结构类似物及其他瘦肉精类药物（γ-氨基丁酸、氯丙那林、可乐定、赛庚啶、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺）交叉反应率均小于0.3%,具有良好的敏感性和特异性。【结论】成功合成了巴氯芬人工抗原,并制备了免疫学特性良好的巴氯芬鼠源多克隆抗体。     

大白菜中拟除虫菊酯类农药残留半定量ELISA免疫检测方法的建立

为建立适合蔬菜中拟除虫菊酯类农药的半定量ELISA免疫检测方法,以实验室自制的针对拟除虫菊酯类农药的广谱性抗体为材料,以间苯氧基苯甲酸(PBA)为半抗原,分别用活性酯法、混合酸酐法和6-氨基己酸法偶联鸡卵清蛋白(OVA)制备3种包被抗原,开展了半定量酶联免疫分析法(ELISA)免疫检测试验。结果表明,采用6-氨基己酸法合成包被抗原效果最优;检测时无需将抗原抗体过夜提前预混,抗原抗体反应时间以45 min较佳;无净化步骤的大白菜基质对检测结果影响较小,该方法对63个大白菜样品的假阳性检出率和假阴性检出率分别为9.3%和2.7%,表明该方法具备对大量大白菜样品快速初筛的应用潜力。     

荧蒽完全抗原的合成及其免疫效果评价

利用戊二醛法合成荧蒽完全抗原,对动物进行免疫效果评价,为荧蒽单克隆抗体的制备及其免疫学检测方法的建立奠定基础。采用戊二醛法将3-氨基荧蒽与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)偶联以制备免疫原和检测原。通过凝胶电泳法与紫外光谱吸收法对合成的人工抗原进行鉴定并免疫Balb/c鼠,利用间接竞争ELISA评价免疫效果。结果表明:荧蒽完全抗原制备成功,免疫动物的血清效价可达到1∶16 000,IC50达到72 ng/m L,抑制率曲线回归方程y=-0.256x+0.975 4,R2=0.999 1。     

SW人工抗原的合成与鉴定

【目的】探索高效苦马豆素(SW)人工抗原SW-BSA的合成方法。【方法】设计新的技术路线,合成SW人工抗原制备的关键中间产物SW-对甲基苯甲酸,并进行波谱分析。应用EDC法将SW-对甲基苯甲酸分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)连接,制备免疫抗原SW-BSA和包被抗原SW-OVA,通过小鼠免疫试验检测所合成的SW-BSA的免疫原性。【结果】合成的SW-对甲基苯甲酸的结构与预期目标产物一致;合成的SW-BSA可刺激小鼠产生针对SW的抗体;通过薄层层析技术可对反应进程进行即时检测。【结论】SW-BSA人工抗原合成成功,该人工抗原具有良好的免疫原性。