表达hTERT及SV40T永生化奶牛乳腺上皮细胞系的建立

构建pcDNA3.1-hTERT、pcDNA3.1-SV40 T载体,线性化后,共转染荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞,研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)和猿猴病毒40大T抗原(SV40 T)对荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞体外培养的作用,并对细胞进行RT-PCR检测分析及免疫荧光鉴定。结果表明,hTERT和SV40 T在奶牛乳腺上皮细胞中表达可以有效地延长细胞的体外培养时间,增加细胞传代次数,获得的细胞系可以正常表达角蛋白。说明在体外培养的乳腺细胞中共表达hTERT和SV40 T可以有效延长细胞寿命且不影响乳腺细胞特性。     

溶葡萄球菌素基因乳腺特异表达载体的构建与检测及转基因核供体细胞的制备

本研究旨在构建溶葡萄球菌素基因牛乳腺特异表达载体(pEPB),转染牛胎儿成纤维细胞,为制备溶葡萄球菌素基因的转基因克隆牛提供核供体细胞.本研究以pEGFP-C1为载体骨架,通过PCR扩增牛2.6 kb的β-酪蛋白5′调控区及0.6 kb的3′侧翼区(poly A)序列作为调控序列,制备成含有绿色荧光和新霉素筛选标记的牛乳腺特异表达载体,经PCR和酶切鉴定正确后,用转染试剂FuGene HD反复转染牛pEPB乳腺上皮细胞3～5次,用催乳素诱导后,经免疫荧光分析,检测目的蛋白的表达.然后,用电转染法转染牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选得到阳性细胞后,把阳性细胞扩大培养并提取其基因组,因为溶葡萄球菌素基因是外源基因,经PCR及Southern blot 检测来确定目的基因是否已经整合到细胞的基因组上.结果表明,溶葡萄球菌素基因在牛乳腺细胞中得到了表达,并整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组中,得到了转溶葡萄球菌索基因的核供体细胞.结果显示,本研究所获得的转基因牛胎儿成纤维细胞可作为体细胞核移植的供体细胞进行转基因克隆牛研究.     

位点特异整合酶φC31的作用机制及应用

链霉菌噬菌体φC31整合酶是一种位点特异整合酶（Sitespecific recombinase,SSR）,其能够精确并单向的促进attP位点与attB位点的重组,是继Cre/Loxp、FLP之后又一个倍受关注的位点特异整合酶,该整合酶已经成为基因治疗、转基因研究等领域的常用技术手段。现对φC31位点特异性整合酶的作用机制、整合位点及其在转基因和基因治疗中的应用进行了综述,并对其发展前景进行了展望。     

培氟沙星人工抗原的合成与鉴定

【目的】制备培氟沙星(Pefloxacin,PEF)完全抗原,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】以培氟沙星与牛血清白蛋白(BSA)为材料,用碳二亚胺(EDC)法制备培氟沙星-牛血清白蛋白完全抗原(PEF-BSA),变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及紫外扫描(UV)检测其免疫学特性;利用PEF-BSA免疫BALB/c小鼠,无菌条件下收集血清,用间接ELISA测定多抗血清(pAb)效价。并用同样的方法制备和鉴定培氟沙星-鸡卵清白蛋白完全抗原(PEF-OVA)。【结果】培氟沙星与牛血清白蛋白及鸡卵清白蛋白偶联成功,PEF-BSA偶联比为8∶1,PEF-OVA偶联比为6∶1。间接ELISA测得多抗血清效价均达到4 000以上,得到了较好的免疫效果。【结论】成功得到了培氟沙星完全抗原,该抗原具有较强的特异性及良好的敏感性。     

溶葡萄球菌素的原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】制备溶葡萄球菌素(lys)的多克隆抗体,为检测其在转基因细胞、胚胎及转基因动物中的表达奠定基础。【方法】以含有lys基因成熟肽序列的PEPB质粒为模板,经PCR扩增,构建pET28a-Ly原核表达载体,并以其转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达并纯化蛋白后,常规免疫家兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体的特异性。【结果】构建的原核表达载体pET28a-Ly经IPTG诱导6h后即可高效表达lys蛋白,蛋白经纯化后,其质量浓度可达到3.05mg/mL;抗体经ELISA检测,效价为1∶27 000,West-ern blot检测结果表明,抗体的特异性较好。【结论】成功构建了lys原核表达载体,所制备的lys多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。     

口蹄疫O型、A型和AsiaⅠ型病毒RT-PCR分型方法的建立

该研究旨在建立一种快速、灵敏及准确的口蹄疫病毒(FMDV)鉴定与分型的RT-PCR检测技术平台,为临床中有效准确地检测口蹄疫病毒提供有力的支持。根据NCBI中公布的FMDV序列(GenBank:JF749861.1),设计FMDV通用检测引物FP1/FP2;根据NCBI中公布的FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型序列,经过序列分析比对后,分别设计FMDV分型引物FO1/FO2、FA1/FA2和FAS1/FAS2。提取FMDVRNA后,利用随机引物扩增得到FMDV全cDNA,利用设计的引物进行PCR扩增及PCR反应条件的优化。结果表明:该研究建立的RT-PCR检测方法具有很好的特异性、敏感性和可重复性。成功建立了FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型检测及分型方法,为口蹄疫疾病的临床检测、流行病学相关调查及针对性的疫苗的制备奠定基础     

不同激素组合对山东白山羊同期发情的比较研究

以山东白山羊为研究对象,应用国产的孕酮阴道海绵栓,结合PMSG/FSH、PG和HCG,将78头受体羊随机分为4组进行同期发情及卵巢排卵研究。结果显示:放栓15 d,同时在去栓前3 d肌注400 IU/只PMSG和去栓前1 d肌注0.1 mg/只PG,鉴定发情后再肌注100 IU/只HCG处理方案效果最好,发情率为84.21%,黄体形成率为75%。同时手术检查卵巢卵泡和黄体形成情况,处理方案中放栓15 d+PMSG+PG+HCG组卵巢上均有多个排卵黄体,并且排卵窝比较明显。该研究所优化的方案为获得高质量的转基因胚胎移植受体羊提供了技术支持。