猪瘟流行毒株E2基因主要抗原区的原核高效表达

【目的】构建猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)E2基因主要抗原区原核表达质粒载体,高效表达E2蛋白,为进一步研究E2亚单位疫苗提供物质基础。【方法】用RT-nested PCR技术扩增CSFV流行毒株SX-YL株E2基因主要抗原区,克隆于表达载体pET32a中,成功构建表达质粒pET32a-E2,将pET32a-E2转入BL21(DE3)受体菌并用IPTG诱导表达E2蛋白,对E2蛋白进行SDS-PAGE电泳、Western-blot分析和可溶性鉴定。【结果】CSFVE2基因得到了高效表达,表达蛋白量占菌体蛋白量的33.2%,表达蛋白E2主要以包涵体形式存在;免疫印迹分析结果表明,表达蛋白E2能识别天然猪瘟多克隆抗体。【结论】E2蛋白表达量高并具有生物学活性。     

猪瘟流行毒株E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

【目的】表达猪瘟保护性抗原E0蛋白,用以建立猪瘟抗体检测方法,为进一步开发诊断试剂盒和研究E0蛋白的免疫学功能奠定基础。【方法】将猪瘟野毒株FJ237-E0基因插入原核表达载体pET32a中,以BL21(DE3)为表达菌株进行诱导表达,将表达的重组蛋白通过His亲和层析柱进行纯化,以纯化的His-E0融合蛋白作为诊断抗原,通过探索抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测猪瘟E0抗体的ELISA方法。【结果】成功克隆了CSFV E0基因,其核苷酸序列为687 bp,编码229个氨基酸。经His亲和层析柱纯化检测纯度为0.587 mg/mL;SDS-PAGE电泳结果显示,表达的E0蛋白分子质量约为50.3 ku,表达的重组蛋白为可溶性蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%;ELISA方阵确定的最佳抗原包被量为100 ng,血清稀释倍数为1∶30,建立的ELISA方法与IDEXX公司猪瘟病毒抗体检测试剂盒的阳性符合率为92.3%,阴性符合率为85.7%。【结论】建立的ELISA检测方法,不但为猪瘟抗体监测提供了一种比较实用的血清学监测手段,也为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定了基础。     

绵羊eIF3h基因克隆、原核表达及蛋白鉴定

【目的】克隆绵羊真核翻译起始因子eI F3h,构建原核表达载体,并诱导外源蛋白表达,检测、鉴定带有His标签的目的蛋白。【方法】根据Genbank中绵羊eI F3h基因CDS序列设计引物,PCR特异扩增DNA片段,酶切、连接至pE T28α(+)载体,将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株中诱导eI F3h蛋白表达。采用SDS-PAGE电泳分析目的蛋白表达情况,利用Western blot技术检测、鉴定目的蛋白。【结果】正确、完整的克隆到绵羊eI F3h基因CDS区序列,片段全长1 059 bp。将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株后,在37℃,1 mmol/L浓度的IPTG诱导3.5 h后获得以包涵体形式存在的目的蛋白,分子量大小约为40 kD。【结论】获得了完整、正解的绵羊eI F3h基因CDS区序列片段,构建了该基因的原核表达载体,成功诱导了绵羊eI F3h基因外源表达的目的蛋白,为绵羊eI F3h基因的后续研究提供了科学数据。     

猪瘟病毒E2基因的克隆及原核表达

利用RT-PCR技术扩增出不含信号肽的猪瘟病毒石门株的E2基因,将其克隆到PGEX-T-Easy 载体上,用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因克隆到表达载体质粒pPROEX-HTb中,获得 重组质粒PPRO,EXE2,用pPROEXE2转化大肠杆菌,诱导含重组质粒PPROEXE2的大肠杆菌BL21表达E2基因蛋 白,研究E2蛋白与猪瘟阳性血清反应的特异性。结果表明,受体菌诱导后能表达E2基因蛋白,所表达的E2蛋白能 与猪瘟阳性血清发生特异性很强的反应。     

抗猪瘟病毒E2蛋白单抗9A4H4的鉴定

为鉴定抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体9A4H4与不同猪瘟病毒(CSFV)株的反应性,将其与猪瘟病毒石门株、猪瘟兔化弱毒疫苗株和前期分离获得的106株猪瘟流行毒株进行IFA验证。在此基础上,利用昆虫杆状病毒系统表达的基因1型、2型和3型代表性毒株的E2蛋白进行了Western blot验证。试验还利用含有或不含β-巯基乙醇的SDS上样缓冲液对真核表达和原核表达的石门株E2蛋白进行处理,并与单抗9A4H4进行反应,初步鉴定了该单抗所识别抗原表位的类型,并利用石门株进行中和试验验证该抗体对CSFV的中和能力。间接免疫荧光试验结果表明:单抗9A4H4能与石门株、猪瘟兔化弱毒疫苗株、基因1型以及大多数的基因2.1b亚亚型、2.2、2.3基因亚型的毒株反应,与绝大多数的2.1a、2.1c、2.1g和2.1h基因亚亚型的毒株不反应,该结果与单抗和病毒E2蛋白的反应结果完全一致。Western blot结果表明:单抗9A4H4只与真核表达的非还原型石门株E2蛋白反应,与真核表达的还原型E2蛋白以及原核表达的石门E2蛋白不反应,表明该抗体识别的抗原表位为构象表位。中和试验结果表明,单抗9A4H4对CSFV石门株没有中和能力。     

丝状支原体山羊亚种特异性蛋白基因Mmc-3740的克隆表达和免疫原性分析

【目的】构建表达丝状支原体山羊亚种特异性蛋白基因Mmc-3740的重组表达菌,为Mmc-3740蛋白的进一步研究与应用奠定基础。【方法】采用PCR技术从Mmc-47中扩增出该基因,进行克隆、测序,将克隆质粒与pET-28a分别双酶切,回收正确的片段进行连接构建重组表达质粒,转化至表达菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,产物用SDS-PAGE检测,用镍柱对其纯化后免疫小鼠获得高免血清,并进行Western-blot验证。【结果】成功构建了克隆和表达载体,重组菌表达目的蛋白大小约21 ku。表达产物通过镍柱纯化后可得到单一的目的蛋白条带,Western-blot检测结果显示所表达的目的蛋白有较好的免疫原性。【结论】成功在BL21(DE3)宿主菌内表达了Mmc-3740重组蛋白。     

水牛朊蛋白成熟片段基因的克隆与原核表达

【目的】克隆、分析水牛朊蛋白（prion protein，PrP）成熟片段基因，并获取纯化的表达产物。【方法】将应用PCR技术扩增的水牛成熟PrP的核酸序列克隆到表达载体pET-32a，并分析其序列；把阳性克隆质粒pET-32a-BPrP转化表达菌BL21(DE3)，鉴定纯化的表达产物。【结果】水牛朊蛋白成熟片段核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其他牛科动物的成熟PrP核酸、氨基酸序列间的相似性分别在97.1%和97.2%以上，并且发现水牛成熟PrP有5个重复序列，编码的氨基酸序列其中有2个九肽和3个八肽重复序列。具有较高的表达水平的PrP融合蛋白被纯化后，用Western印迹实验证明该蛋白具有PrP抗原活性。【结论】首次报道了克隆、分析水牛朊蛋白成熟片段基因，发现水牛成熟PrP有5个重复序列，并获得了具PrP抗原活性的水牛成熟PrP融合蛋白。     

棉铃虫核型多角体病毒几丁质酶的原核表达及其协同增效作用

【目的】在大肠杆菌中表达棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒(HearNPV)几丁质酶(Chi A),利用表达产物进行病毒增效作用研究,以明确杆状病毒Chi A对HearNPV的协同增效作用。【方法】用PCR方法扩增出不含N端信号肽编码序列的Chi A基因片段,分别克隆至原核表达载体pMAL-p2x和pET-32a中,构建重组表达载体,并分别在大肠杆菌TB1和BL21(DE3)中进行融合表达,测定融合蛋白对HearNPV的增效作用。【结果】克隆的基因片段经过测序后连接表达载体,成功构建了重组表达载体pMAL-p2x-Chi A和pET-32a-Chi A。重组载体转化相应菌株并进行诱导表达,发现pMAL-p2x-Chi A在大肠杆菌TB1中的表达量占细菌总蛋白的15.8%,其中20.0%为可溶性表达;pET-32a-Chi A在BL21(DE3)中的表达量占细菌总蛋白的26.8%,其中30.2%为可溶性表达。选用pET-32a-Chi A在BL21(DE3)中的表达产物作为增效蛋白,当表达的可溶性HearNPV Chi A的添加水平为1.0μg/mL时,其能够显著提高病毒毒力,棉铃虫的死亡率较对照提高36.6%。【结论】利用大肠杆菌表达的可溶性HearNPV Chi A,对HearNPV具有明显的增效作用。     

抗果蝇组蛋白乙酰转移酶Atac2单克隆抗体的制备

【目的】制备抗果蝇组蛋白乙酰转移酶Atac2的单克隆抗体,为进一步研究Atac2基因的功能提供重要的试验工具。【方法】PCR扩增果蝇Atac2蛋白N端前26个氨基酸的编码基因,构建GST-Atac2融合蛋白表达载体pGEX-Atac2。转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),进行诱导表达,通过GST亲和层析法纯化GST-Atac2融合蛋白。以GST-Atac2为抗原免疫8周龄的Balb/c小鼠,取脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法检测阳性孔,经有限稀释法亚克隆,筛选单克隆杂交瘤细胞株,检测抗体的特异性、效价和亚型,并检测其亲和常数。【结果】PCR扩增获得了目的片段。成功构建了GST-Atac2融合蛋白表达载体,于37℃下220r/min振摇5h,当IPTG终浓度为0.1mmol/L时,GST-Atac2在E.coli BL21(DE3)中高效表达,GST-Atac2融合蛋白大小约为30ku,与预期结果一致。获得1株稳定分泌抗Atac2抗体的杂交瘤细胞株,命名为1C7。单抗1C7能够特异地识别GST-Atac2蛋白,效价为1∶2×105;亚型鉴定表明其重链为IgG1,所得单克隆抗体的亲和常数为2×105。【结论】获得了1株特异性好、能够稳定分泌抗果蝇Atac2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。     

猪瘟病毒E2蛋白的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

以猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)标准强毒石门株为模板,RT-PCR扩增CSFV E2基因N端的主要抗原区(△E2).PCR产物定向克隆至原核表达载体pET-32a中,构建了重组表达质粒pET-AE2,转化Eacterium coli BL21-Codonplus(DE3),IPTG诱导重组△E2蛋白表达,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达.KCl预染切胶法纯化△E2蛋白,以其为包被抗原,通过反应条件的优化,建立了CSFV抗体ELISA检测方法.用该方法对331份临床血清进行检测,并与IDEXX公司阻断ELISA试剂盒进行了相符性验证,符合率为74%.为研制猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒奠定了基础.     

E2蛋白介导猪瘟病毒的细胞吸附与内化

【目的】已有研究显示,猪瘟病毒(CSFV)通过网格蛋白介导的内吞作用侵入宿主细胞,然而参与侵入过程的病毒蛋白尚待阐明。研究旨在明确E2蛋白在CSFV侵入过程中的作用。【方法】通过瞬时转染包装携带E2基因的慢病毒,将慢病毒转导悬浮293细胞构建稳定表达重组E2蛋白的悬浮293细胞系,利用亲和层析的方法纯化重组E2蛋白,同时优化表达时间以增加蛋白产量。利用SDS-PAGE和Western blotting分别鉴定了重组E2蛋白的表达水平及其反应原性。通过感染试验、吸附试验以及内化试验分别探究了E2蛋白对CSFV感染、吸附以及内化的影响。将重组E2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过阻断ELISA检测血清中多克隆抗体的阻断率。利用制备的多克隆抗体与CSFV感作后进行吸附和内化试验,进一步探究了E2蛋白在介导CSFV吸附和内化中的作用。【结果】通过倒置荧光显微镜观察转导慢病毒后的细胞系,与对照细胞相比可见明显的绿色荧光,表明慢病毒成功转导悬浮293细胞。SDS-PAGE结果显示,在还原和非还原条件下均出现与预期大小相符的蛋白条带,经Western blotting验证,上清中表达的重组E2蛋白能够被抗E2蛋白单克隆抗体WH303所识别,表明构建的悬浮293细胞系能够表达重组E2蛋白。通过优化表达条件,悬浮293细胞培养第8天时上清中重组E2蛋白浓度最高可达5.84μg·m L-1。可溶性蛋白阻断试验结果显示,重组E2蛋白具有阻断CSFV感染的活性。利用重组E2蛋白在病毒入侵过程中处理细胞对CSFV的感染同样具有显著抑制作用;阻断ELISA和中和试验结果显示,针对E2蛋白的多克隆抗体能够阻断CSFV感染,且具有良好的中和活性;吸附试验和内化试验证明,重组E2蛋白处理细胞能够显著抑制CSFV的内化,而利用多克隆抗体与CSFV感作后能够显著抑制其吸附。【结论】E2蛋白参与CSFV吸附和内化。     

利用E.coli表达猪圆环病毒2型Cap蛋白生产病毒样颗粒疫苗

【目的】研究利用大肠杆菌可溶性表达PCV2b亚型ORF2基因,利用重组Cap蛋白制备PCV2 VLP疫苗的可行性。【方法】 根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2 NJ株ORF2基因,将其插入原核表达载体pQZ1,鉴定阳性后转入表达宿主菌BL21,利用原核表达平台CVC1102对重组菌进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blotting对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析;利用电镜分析技术鉴定重组Cap蛋白VLP组装;利用BCA试剂盒测定重组大肠杆菌破碎后上清中总蛋白量,利用薄层扫描分析确定目的蛋白百分比,得出目的蛋白量,将重组Cap蛋白的浓度调整为1 mg·mL^-1。使用不同剂量的重组蛋白与206佐剂乳化,免疫2-3周龄抗原抗体双阴性的仔猪,同时设含免疫增强剂CVC1301、CVC1302的试验组、同类制品免疫对照组与空白对照组,免疫后14 d与21 d所有试验猪采血,分离血清,利用武汉科前生物科技有限公司的猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒检测试验猪血清中PCV2抗体水平;免疫后28 d试验猪按照兽用生物制品质量标准汇编中公布的PCV2攻毒程序,利用PCV2 NJ株F₆代进行强毒攻击试验,肌肉注射与口服PCV2 NJ株各10^5.0TCID₅₀,同时利用乳化的钥匙孔血蓝蛋白及硫酸巯基乙醇培养基进行免疫刺激,攻毒后25 d,对所有试验猪进行解剖检测,通过攻毒过程中试验猪体温变化、试验猪平均相对日增重、解剖时试验猪肺部与相关淋巴结的大体变化及攻毒后PCV2核酸检测等4个方面评价大肠杆菌表达制备的PCV2 VLP的免疫效力。【结果】SDS-PAGE结果表明PCV2 NJ株优化的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达产物以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中;Western blotting分析结果显示表达的重组Cap蛋白能够与PCV2阳性血清发生反应;电镜下观察可见大量直径在17 nm左右的PCV2病毒样颗粒存在于超声破碎后的上清中;500 μg/头重组VLP疫苗免疫猪产生较高的抗体水平,单次免疫后21 d抗体100%达到合格,对PCV2强毒的攻击提供完全保护。【结论】实现了PCV2 Cap蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达,重组Cap蛋白体外自我组装成病毒样颗粒,且具有良好的免疫原性,可用于制备PCV2亚单位疫苗。     

细粒棘球绦虫Hsp70基因的克隆、表达及抗体制备

【目的】克隆细粒棘球绦虫( Echinococcus granulosus , E.g)热休克蛋白家族基因Hsp70,在原核细胞中表达、纯化Hsp70蛋白并制备其特异性抗体。【方法】 从包囊中分离原头蚴,提取RNA,RT-PCR扩增EgHsp70基因的cDNA,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株。通过改变诱导温度、IPTG浓度和诱导时间筛选出EgHsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件。并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白。纯化蛋白经皮下多点注射免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blotting检测血清效价和特异性。【结果】 RT-PCR扩增获得EgHsp70基因的cDNA,酶切和测序结果表明EgHsp70基因已克隆入pMAL-p2x。表达条件优化实验结果筛选出Hsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件为：当A600为0.6时,以0.3 mmol•L-1 IPTG于30℃条件下诱导表达4 h。SDS-PAGE显示Hsp70融合蛋白相对分子质量约为68.6kD,经麦芽糖亲和层析法纯化获得了Hsp70融合蛋白,其表达量为2.5 mg•L-1。Western blotting 检测证明制备的抗血清与EgHsp70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、E.granulosis虫体蛋白和E.granulosis虫体表面蛋白均能特异性结合,ELISA检测表明获得的抗血清效价达到 1﹕256 000。【结论】在大肠杆菌中表达并纯化获得了EgHsp70融合蛋白,并制备了高效价的兔抗EgHsp70蛋白抗血清,为研制包虫病疫苗及相关诊断试剂奠定了基础。     

猪细小病毒NS1蛋白的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

【目的】建立一种快速检测猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）野毒抗体的方法。【方法】参照已发表的PPV基因组（AY502114.1）序列设计合成特异性引物,利用PCR扩增PPV-NS-1基因主要抗原区域,将目的片段定向克隆至表达载体pET30a(+),转化BL21（DE3）表达菌,用IPTG诱导表达重组蛋白。以该蛋白作为诊断抗原,经过对间接ELISA条件的优化,建立检测PPV抗体的NS1-ELISA诊断方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行检测。用建立的PPV NS1-ELISA诊断方法和血凝抑制试验（HI）同时对临床送检的306份血清样品进行检测,比较二者的符合率。【结果】成功扩增了870 bp的NS1基因部分片段,构建了pET30a-NS1原核表达载体,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白作为诊断抗原,建立了检测猪细小病毒抗体的NS1-ELISA诊断方法。该方法与猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪乙脑病毒（JEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）等7种常见猪病病毒的阳性血清均不发生反应;该方法检测敏感性为1∶12 800;批内重复性试验和批间重复性试验中样品的变异系数分别小于5%和10%。PPV NS1-ELISA检测方法与HI的符合率为96.2%。【结论】制备了NS1重组蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,以其作为包被抗原建立的PPV NS1-ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PPV的快速诊断和流行病学调查等提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

欧李八氢番茄红素合成酶cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的功能表达

 【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。     

华山新麦草α-醇溶蛋白基因的克隆及原核表达分析

 【研究目的】克隆华山新麦草（Psathyrostachys huashanica）的α-醇溶蛋白基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。【方法】采用同源克隆法从华山新麦草基因组DNA中分离克隆出α-醇溶蛋白基因并进行序列分析,将克隆的华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5克隆到表达载体pET-28a (+)上,获得重组质粒pET28a-Gli-Ns转化大肠杆菌BL21 (DE3)并诱导表达。【结果】从华山新麦草基因组DNA中克隆了4个α-醇溶蛋白基因：Gli-Ns-2 (FJ713595)、Gli-Ns-3 (GQ139525)、Gli-Ns-4 (GQ139526)和Gli-Ns-5 (GQ139527)。序列分析表明,4条序列具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特征,含有8个或9个半胱氨酸残基,序列FJ713595为假基因。利用所构建的大肠杆菌表达载体,经IPTG诱导,华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核系统中特异性表达。Western-blot证实融合蛋白可成功表达。【结论】克隆了4个华山新麦草的α-醇溶蛋白基因序列,基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核表达系统中成功表达,为小麦品质改良提供了新的候选基因。     

鸭leptin基因在大肠杆菌中的融合表达及生物学活性分析

 【目的】研究鸭leptin在体外高效表达特点，探讨表达产物的生物学活性及其功能。【方法】构建重组鸭leptin基因原核表达菌株，重组菌株经不同浓度IPTG和不同时间诱导后，对表达蛋白进行提取、纯化、复性和浓缩，经注射昆明小鼠后，对小鼠的体重﹑采食量和体脂含量进行分析。【结果】鸭leptin在大肠杆菌中实现了高效特异性融合表达，融合蛋白分子量约为20 kD，其中16 kD为鸭leptin基因表达产物，目的蛋白在0.2 mmol•L-1 IPTG的诱导下，表达量最高约占菌体总蛋白的57%。重组蛋白纯化﹑复性﹑浓缩后，能够明显降低小鼠摄食量、体重和体脂含量。【结论】鸭leptin基因在大肠杆菌中进行了高效融合表达，表达产物具有明显的生物学活性。     

拟南芥AtCOR15a抗寒基因原核表达载体的构建及蛋白表达

[目的]通过RT-PCR获得拟南芥AtCOR15a基因的ORF全长,经酶切、连接,以pET-28a(+)为原核表达载体.构建成pET28a-COR15a的重组表达载体,研究该基因在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]根据拟南芥AtCOR15a基因序列设计特异引物,利用RT-PCR的方法扩增目的基因,构建原核表达载体pET28a-COR15a,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,验证其蛋白表达量,并对其体系进行优化.[结果]AtCOR15a在大肠杆菌中成功表达,在37℃条件下诱导表达量最大,而30和16℃条件下蛋白表达量降低,IPTG浓度0.2～1.0 mmol/L对蛋白的表达量影响不大,并没有明显差异.但通过在不同诱导时间取样分析,结果发现加入IPTG后诱导5 h蛋白表达量最大,而8 h后逐渐降低.[结论]构建的原核表达载体在大肠杆菌中能高效表达,AtCOR15a融合蛋白分子量大约为19 kD,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

普通烟草铁氧还蛋白I的原核表达、抗体制备及在ToMV侵染烟草体内表达分析

【目的】构建普通烟草铁氧还蛋白I(ferredoxin I,Fdn-I)原核表达载体,表达可溶性Fdn-I蛋白,并制备其多克隆抗体,分析Fdn-I在ToMV侵染烟草叶片内的表达情况。【方法】以Fdn-I全长cDNA为模板,用PCR扩增Fdn-I,克隆至原核表达载体pEGX-6p-1,构建Fdn-I与GST融合表达载体pEGX-Fdn-I,重组质粒转化原核表达菌株BL21,优化GST-Fdn-I可溶性表达条件后大量表达蛋白,用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-Fdn-I蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价,Western印迹法检测抗体的特异性和ToMV侵染前后烟草叶片内Fdn-I的表达情况。【结果】在温度为28℃,IPTG诱导浓度为0.3 mmol?L-1条件下表达出大小为41.3 kD的可溶性融合蛋白。纯化获得约4 mg可溶性蛋白,免疫家兔制备了效价为1/6 400的多克隆抗体。Western印迹结果表明,该抗体可以与Fdn-I的原核和酵母表达产物特异性结合。分析表明Fdn-I在ToMV侵染后烟草叶片内含量明显低于其在健康烟草叶片内的含量。【结论】通过Fdn-I大肠杆菌中的可溶性表达,制备获得了其高效价特异性多克隆抗体,利用该抗体检测表明ToMV侵染烟草降低了Fdn-I的表达。