小麦ISSR分析初探

以小麦基因组DNA为模板,对ISSR反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化试验,建立了一套小麦ISSR分析的最优化反应体系及反应程序。即25μL反应体系中,含有2．0mmol／L Mg2^ 、150μmol／L dNTP、200nmol/L引物、60ng模板DNA、2．0U Taq DNA聚合酶：反应程序为第1个循环基因组DNA经94℃预变性3min;40个循环为94℃变性30s,48℃退火60s．72℃延伸90s;最后1个循环完成后,在72℃下延伸7min。     

人参黑斑病菌RAPD反应体系的优化

采用改良的CTAB法提取人参黑斑病菌的基因组DNA,建立人参黑斑病菌RAPD反应的体系.最佳体系容积为25μL,其中包括10×Taq配套缓冲液2.5μL,模板DNA 20 ng/μL,引物15 pmol/L,dNTP 150μmol/L,Taq DNA聚合酶1 U,Mg2+1.5 mmol/L,其余部分用DW补充.PCR扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,40℃退火1 min,72℃延伸2 min,40次循环,72℃延伸7 min.     

荸荠基因组DNA的提取及RAPD反应体系的建立

以荸荠叶状茎为试验材料,采用改良的SDS法提取其基因组DNA,并对其RAPD反应体系进行优化,建立了荸荠的RAPD—PCR优化反应体系和程序。结果表明,提取的基因组DNA纯度和完整性较好,OD260/OD280值在1．8～2．0之间,DNA无降解现象,完全可以满足RAPD—PCR扩增要求。建立了荸荠RAPD反应体系：总体积为25μl,各有关成分的最佳浓度分别为25mmol／L Mg^2＋,1．0UTaqDNA聚合酶,0．2mmol／L dNTPs,1μmol／μl引物,1．5ng／μl DNA模板。PCR反应程序为：94％预变性3min;94℃变性1min,37℃退火30s,72℃延伸60s,40个循环;最后72％延伸10min。     

正交设计优化茄子SSR反应体系

以茄子基因组DNA为模板,利用正交设计方法对茄子SSR反应体系中的Mg^2＋、模板DNA、Taq聚合酶、dNTP、引物5个因素进行了优化,同时对反应程序中的退火温度及循环次数进行筛选。结果确定了茄子10μL体积SSR反应体系的最优条件为：Buffer为1μL,Mg^2＋为2．25mmol·L^-1,dNTP为400μmol·L^-1,上下游引物各为39.60ng,Taq聚合酶为0．75U,DNA约为100ng。PCR程序为94℃预变性2min：然后进行35个循环的94℃变性30s,52℃复性30s,72℃延伸45s;72℃延伸8min后4℃保存。     

利用正交设计优化桃SRAP-PCR反应体系

以桃基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从Mg2+、Taq酶、dNTP、引物、模板5种因素4个水平对桃SRAP反应体系进行优化,建立了适合于桃的SRAP-PCR优化反应体系,该25μL反应体系:模板DNA50 ng,MgCl22.5 mmol/L,dNTP200μmol/L,上下引物各0.4μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U,以灭菌双蒸水补齐至25μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,5个循环;94℃变性1 min,50℃复性1 min,72℃延伸1 min,35个循环,72℃延伸10 min。     

结球甘蓝RAPD反应条件的优化

以甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)基因组DNA为模板,比较筛选RAPD扩增体系的各影响因素,优化了甘蓝的RAPD反应体系,调整了扩增程序.该体系反应总体积为20μL,其中25mmol/L MgCl2 2.0μL,10×PCR Buffer 2.0μL,10mmol/L dNTP 0.5μL,5U/μL Taq E 0.5μL,20ng/μL Primer 1.5μL,10ng/μL模板DNA 3μL,灭菌双蒸水10.5μL.适宜的扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性1min,37℃复性1min,72℃延伸1.5min,40个循环;72℃延伸10min后15℃保存.     

长筒石蒜花被片DNA的提取及ISSR体系的建立

以长筒石蒜为例,探讨了花被片DNA的提取方法。并在此基础上,确立其ISSR反应程序及体系。反应程序为: 94℃预变性3min,进入38个PCR循环( 94℃变性30s, 58℃复性30s, 72℃延伸90s),最后于72℃延伸7min。扩增反应总体积为20μL: 1×Taq酶扩增缓冲液, 1. 5mmol/LMg2+, 200μmol/LdNTP, 0. 5μmol/L随机引物, 0. 5UTaq聚合酶,DNA模板10~30ng。     

假臭草DNA提取及RAPD反应体系的优化

以假臭草叶片为材料,对影响其随机扩增多态DNA（RAPD）反应的各因素进行优化．建立了假臭草RAPD的优化反应体系和程序,即在10μL反应体系中,5ng（／10μL）模板DNA,1．0μmol／L随机引物F15,150μmol／LdNTPs,2．0mmol／LMg^2＋,1．0UTaqDNA聚合酶;扩增程序为95℃预变性4min,95℃变性40S,36℃退火40S,72℃延伸1min,10个循环,后94℃变性30s,35℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸5min,4℃保温。     

茄子RAPD分子标记体系的建立与优化

采用改良的CTAB法提取茄子基因组DNA,并通过单因素多水平梯度试验,比较筛选RAPD扩增体系的各影响因素,建立了茄子RAPD-PCR的最佳反应体系:20μL反应体系其中含25 mmol/L MgCl2 2.0μL1、0×PCR Buffer 2.0μL、10mmol/L dNTP 0.5μL5、U/μL Taq E 0.2μL0、.1μmol/L Primer 3μL1、0 ng/L模板DNA 3μL、灭菌双蒸水9.3μL。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,37℃退火1 min7,2℃延伸1.5 min4,5个循环;72℃延伸10 min后4℃保存。     

菜心ISSR-PCR反应体系的优化

以菜心（Brassica campestris L．ssp．Chinensis Var．utilis Tssen．et Lee．）为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如Mg^2＋、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Primer、模版DNA的浓度及引物退火温度、延伸时间和循环次数进行了探讨,确立了适合菜心ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数：在25pL反应体系中含10×buffer 2．5μL,2．0mmol／LMg^2＋,0．5U Taq DNA聚合酶,0．2mmol／LdNTPs,0．5μmol／L引物,30ng模板DNA．PCR扩增程序：94℃预变性3min;94℃变性1min,49．7～56℃退火（退火温度随引物不同而定）1min,72℃延伸45s,40个循环;72℃延伸5min．     

枣cDNA-AFLP技术体系建立与优化

建立了枣(Ziziphus jujuba Mill.)cDNA-AFLP分析的优化体系和反应程序。提取获得的总RNA以人工合成的Oligo(dT)18为引物,利用鼠源反转录酶(M-MLV RT)合成cDNA第1链,合成双链cDNA后用限制性内切酶EcoRⅠ(识别6个碱基位点)与MseⅠ(识别4个碱基位点)酶切,酶切连接后,使用与接头序列互补的预扩引物对cDNA片段池进行PCR扩增,扩增后的cDNA池定量至1 ng/μL,作为选择性扩增的模板,优化得到的选扩反应体系为:20μL的反应体系中含5μL模板,2μL 10×PCR buffer,2μL MgCl2(25 mmol/L),EcoRⅠ特异性引物(50 ng/μL)1μL,MseⅠ特异性引物(50 ng/μL)1μL,10 mmol/L dNTP0.4μL,5 UTaqDNAPolymer-ase 0.12μL。选扩程序:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,65℃退火30 s(每个循环降0.7℃),72℃延伸1 min,13个循环;94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,31个循环;72℃7 min。     

新疆野苹果SSR-PCR 反应体系的优化

以4个新疆野苹果株系为试材,利用CTAB法提取DNA,对影响SSR-PCR扩增结果的主要因子设计了多梯度的优化试验。结果表明:新疆野苹果SSR-PCR反应体系(25μL)中含Taq DNA聚合酶0.5 U、模板DNA 5.0 ng、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.2μmol/L、Mg2+1.0 mmol/L、退火温度为60℃时效果最佳。最佳扩增程序为:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,65℃退火1 min,72℃延伸1 min,4个循环;94℃变性30 s,60℃退火1 min,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸5 min,4℃保存。利用此反应体系对30份新疆野苹果进行SSR-PCR扩增和电泳检测,扩增谱带清晰且多态性较好,表明该体系适用于新疆野苹果的基因连锁图谱构建和QTL定位。     

苦楝RAPD反应体系的优化

以苦楝叶片提取的基因组DNA为材料,通过单因素多水平梯度试验,筛选DNA模板,Mg^2＋,Taq DNA聚合酶,dNTPs和随机引物的浓度及用量,建立苦楝RAPD技术分析体系.结果表明：当基因组DNA浓度为60 ng/μL,镁离子浓度为3.0 mmol/L,dNTP浓度为0.25 mmol/L,引物浓度为0.30μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1 U/20μL,反应体系总体积20μL时,出现可辨认的清晰谱带.其扩增程序为：94℃预变性2 m in;然后38个循环（94℃变性30 s,37℃退火1 min,72℃延伸80 s）;最后72℃延伸8 min,4℃保存.     

黄麻DNA提取与RAPD反应体系的建立

以假黄麻、假长果、越南圆果 (圆果种黄麻 )等为材料 ,研究了黄麻 DNA的提取方法以及对 RAPD分析的影响因素 ,包括模板浓度、Mg2 + 、d NTP、引物和 Taq酶等 ,建立了适于黄麻种质 RAPD分析的 PCR反应体系 .即在 2 5μL反应体积中 ,Tris- HCl(p H8.0 )、KCl、Mg Cl2 、d NTP、随机引物的浓度分别为 10 mmol· L-1、5 0mmol·L-1、2 .5 mmol· L-1、15 0 μmol· L-1、0 .2 μmol· L-1,并含有 30 - 60 ng DNA与 1.5 U Taq DNA聚合酶 .扩增程序为 :94℃预变性 5 min;然后 94℃ 30 s,37℃ 1.5 min,72℃ 1min,4 1个循环 ;最后 72℃延伸 7mi     

均匀设计优化喜盐鸢尾ISSR-PCR体系

以新疆野生喜盐鸢尾DNA为模板, 采用U20(54)和U12(34)均匀设计表,通过4因素5水平和4因素3水平两轮均匀优化试验,对影响ISSR-PCR扩增结果的一些因素如Mg2+ 、dNT P、引物以及TaqDNA聚合酶浓度以及循环数和退火温度等进行优化筛选, 建立了适合喜盐鸢尾的最佳ISSR-PCR反应体系:在25 μL反应体系中,包括2.5 μL 10×PCRBuffer ,2.0mmol/L M g2+,250 μmol/L dNTP,0.1 μmol/L 引物,0.5U TaqDNA 聚合酶,40 ng模板DNA.扩增程序为 :94℃预变性3 min;接着进行40个循环:94℃变性45 s,52.1℃退火30 s,72℃延伸1.5 m in;循环结束后,72℃延伸5 min,4℃保存.     

珙桐基因组DNA的提取及ISSR-PCR体系的优化

采用改良的CTAB法提取珙桐基因组DNA,并采用正交试验设计方法优化其ISSR-PCR反应体系。结果表明：改良CTAB法提取基因组DNA的质量符合ISSR-PCR扩增反应的要求。最佳反应体系为：20μL反应液中含有2.0μL10×buffer、2.75 mmol/L Mg^2＋、0.125 mmol/L dNTPs、0.7μmol/L引物、0.75 UTaq酶和40 ng模板;PCR反应参数为：94℃5 min;94℃30 s,53.2℃45 s,72℃1 min,共40个循环;72℃7 min。     

寒兰基因组DNA ISSR-PCR反应条件的优化

以改良的CTAB法提取的寒兰（Cymbidium kanran Makino）基因组DNA为模板,通过单因子试验建立最适的寒兰的ISS-PCR反应体系。结果表明,适宜寒兰ISSR-PCR反应体系的扩增条件为：25 μl PCR 反应体积中,1×PCR buffer,2.0 mmol/L MgCl2,300 ng 模板 DNA,200 μmol/L dNTP,1.40 U Taq DNA 聚合酶,0.4 μmol/L 引物。最佳扩增程序为：94 ℃预变性 5 min,然后进行40个循环：94 ℃ 变性 30 s,复性温度根据各引物的Tm值略低1～2 ℃,30 s,72 ℃ 延伸 50 s,循环结束后 72 ℃ 延伸7 min。     

石榴ISSR-PCR反应体系的优化研究*

 以酸绿籽石榴为试材,对ISSR反应体系中的各个主要影响因子进行优化筛选。结果表明：25 μL　ISSR反应体系各组分的最适浓度分别为：1×buffer（不含Mg²⁺),1.5 mmol/L Mg²⁺,0.2 mmol/L dNTPs,TaqDNA聚合酶1.5 U,引物0.3 μmol/L,模板40ng。反应程序为：94 ℃预变性4 min,94 ℃变性45 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,40个循环,最后72 ℃延伸10 min。该体系的建立为从DNA分子水平进一步研究石榴种质资源遗传多样性、系统分类、品种鉴定奠定基础。