嗜水气单胞菌气溶素的原核表达及其多克隆抗血清的制备

根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)气溶素(aerolysin,Aer)基因的序列设计引物,以来自湖北的鱼源A.hydrophila分离株为模板扩增出aer基因的ORF序列,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定。测序结果表明,A.hydrophila的aer基因的系统进化树中国内菌株聚为一支,国外菌株聚为一支。通过pET-32a(+)载体构建Ah15株aer基因的表达载体pET32a-15,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约72.2ku相吻合的融合蛋白带,且以包涵体形式存在。浓缩后的包涵体蛋白免疫新西兰大白兔获得了重组蛋白的抗血清,Western blot结果显示,兔抗血清可以识别A.hydrophila的重组毒素,说明该基因的重组蛋白具有很好的免疫原性,可作为A.hydrophila基因工程疫苗研制的候选基因。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因DNA疫苗载体的构建及分析

为构建嗜水气单胞菌的DNA疫苗载体,根据已发表的该菌外膜蛋白基因momp的核苷酸序列设计一对特异性引物,应用PCR技术,扩增到嗜水气单胞菌L316的主要外膜蛋白基因,并插入到真核表达载体pcDNA3上,构建成DNA疫苗,命名为pcDNA3-POMP。以纯化的原核表达蛋白GST-POMP免疫SD大鼠制备抗血清,用ELISA测定抗体效价达到1∶100 000以上;用pcDNA3-POMP质粒转染293细胞,转染48h后收集细胞,提取细胞的RNA进行RT-PCR,检测到外源基因的表达。至此,初步完成嗜水气单胞菌DNA疫苗表达载体的构建,为进一步疫苗免疫和效价的检测奠定基础。     

多重PCR技术检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌毒性基因研究

气溶素和溶血素是β-溶血性嗜水气单胞菌的重要毒力因子。为建立检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌气溶素基因(aer A)和溶血素基因(ahh1)的技术,本文采用多重PCR技术检测28个来源于食用鱼类产品的β-溶血性嗜水气单胞菌样本(包括鲤鱼片、水、鲫鱼片、鳟鱼片、鲢鱼片、鲑鱼片和带鱼片),并用标准菌株嗜水气单胞菌ATCC7965和分离于死蟒蛇的带有β-溶血性毒素基因的嗜水气单胞菌作为对照。结果表明,所有菌株样本(100%)被证实携带嗜水气单胞菌16S rRNA基因(356个碱基对),所有嗜水气单胞菌样本(100%)被证实携带ahh1毒性基因(130个碱基对),26个嗜水气单胞菌样本(93%)被证实携带aerA基因(309个碱基对)。本研究证实β-溶血性嗜水气单胞菌菌株广泛存在于供人类食用的鱼类产品中,对消费者产生了一定的健康风险。     

AmrB对嗜水气单胞菌氨基糖苷类抗生素耐药性的影响

AmrB是药物外排系统的重要成员,探讨AmrB与嗜水气单胞菌氨基糖苷类抗生素耐药性的关系,对研究嗜水气单胞菌耐药机制有重要意义。将amrB基因克隆至pET-28a载体上,双酶切和测序验证得到重组质粒amrB-pET-28a。对amrB-pET-28a/BL21进行诱导表达和镍柱纯化,制备得到效价为1∶6 400的兔抗AmrB抗血清。诱导获得嗜水气单胞菌AH1卡那霉素、链霉素和庆大霉素耐药菌株,Western blotting分析AmrB在耐药菌株中的表达量。Phoretix 1D和SPSS分析表明,AmrB的表达量在卡那霉素、链霉素和庆大霉素耐药菌株中显著地高于对照菌嗜水气单胞菌AH1,分别是对照的2.16、2.65和2.13倍,提示AmrB在嗜水气单胞菌对氨基糖苷类抗生素耐药过程中起重要作用,这将有助于了解嗜水气单胞菌耐药的分子机制。     

食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌毒性基因的多重PCR检测技术研究

本研究目的是建立检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌气溶素基因(aerA)和溶血素基因(ahh1)的技术。气溶素和溶血素是β-溶血性嗜水气单胞菌重要的毒力因子。多重PCR技术被应用于检测28个来源于食用鱼类产品的β-溶血性嗜水气单胞菌样本,包括鲤鱼片,水,鲫鱼片、鳟鱼片、鲢鱼片、鲑鱼片和带鱼片。该研究使用标准菌株嗜水气单胞菌ATCC7965和分离于死蟒蛇的带有β-溶血性毒素基因的嗜水气单胞菌作为对照。所有菌株样本(100%)被证实携带嗜水气单胞菌16srRNA基因(356个碱基对)。所有嗜水气单胞菌样本(100%)被证实携带ahh1毒性基因 (130个碱基对)。26个嗜水气单胞菌样本(93%)被证实携带aerA基因(309个碱基对)。本研究证实β-溶血性嗜水气单胞菌菌株广泛存在于供人类食用的鱼类产品中,对消费者产生了一定的健康风险。     

鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的原核表达、免疫保护及抗血浆杀菌作用研究

研究鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的免疫学功能,为相关疫苗开发奠定理论基础。采用生物信息学方法分析P5的理化性质;分子克隆构建P5表达菌株并确定其最佳诱导表达条件,包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化P5蛋白,并免疫小鼠制备P5抗血清;Western blotting检测抗血清特异性与效价,免疫酶联法模拟P5抗血清对嗜水气单胞菌的体外识别;P5抗血清被动免疫红鲫,攻毒以评价P5蛋白的免疫保护功能;Western blotting分析P5蛋白抵抗鱼血浆的杀菌作用。结果表明:P5蛋白在气单胞菌属间同源性较好,进化保守。成功克隆表达、纯化P5蛋白,其最佳表达条件为:诱导时菌液浓度OD_(600)=1.0,IPTG浓度0.5 mmol/L,32℃诱导8 h。Western blotting验证P5抗血清特异性较好,效价达到1∶1 600,ELISA显示P5抗血清与嗜水气单胞菌存在识别作用,表明P5蛋白具有较好的免疫原性与抗原性。被动免疫显示P5抗血清对红鲫的免疫保护率为显著性的56%,具有良好的免疫保护作用。Western blotting发现P5蛋白可通过表达下调有效抵抗鱼血浆的杀菌作用,表明其可能与细菌抗血浆杀菌有关。综上,嗜水气单胞菌外膜蛋白P5是一种保护性抗原,有望作为防治嗜水气单胞菌感染的疫苗候选成分。     

嗜水气单胞菌ERIC-PCR指纹图谱多样性研究

对采集自江苏、河南、福建等地淡水养殖区域的105株嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了基因分型,并探讨嗜水气单胞菌的基因型与区域分布及生态位的关联性。该实验以ERIC-PCR技术进行分型,应用Quantity one 4.6对电泳图谱进行分析,采用非加权配对法(UPGMA法)做遗传分析的树状图。结果表明,105株嗜水气单胞菌可分为28个基因型。其中,XV基因型的菌株相对最多,Ⅳ、Ⅺ、ⅩⅫ、ⅩⅩⅤ、ⅩⅩⅥ、ⅩⅩⅦ和ⅩⅩⅧ基因型的菌株相对最少。生态位背景来源相似的菌株有聚类趋势。此外,不同地域、不同生态位的嗜水气单胞菌也可能聚为同一种基因型。由此推断嗜水气单胞菌的基因型可能与生态位及地理位置有一定的关联性。     

鳊鱼出血病嗜水气单胞菌的分离·鉴定与ERIC-PCR指纹图谱研究

[目的]对鳊鱼嗜水气单胞菌进行分离与鉴定。[方法]从鳊鱼中分离出嗜水气单胞菌,并进行16S rDNA特异性分子鉴定。分析嗜水气单胞菌的生化特征,并构建嗜水气单胞菌ERIC-PCR指纹图谱。[结果]分离株的测序结果与GenBank中嗜水气单胞菌的标准菌株序列相似度达98%～99%。分离菌的生化特征结果均呈阳性。同一菌株的ERIC-PCR具有较好的重复性和稳定性,可用于嗜水气单胞菌的分型溯源。[结论]该研究为预防和控制鳊鱼出血病的发生和蔓延提供了参考。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白AH6169的生物信息学分析及其原核表达

为嗜水气单胞菌外膜蛋白AH6169亚单位疫苗的研究奠定理论基础,采用生物信息学方法分析了AH6169的理化性质、结构与功能;分子克隆构建AH6169表达菌株,正交试验筛选其最佳诱导表达条件;通过包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化AH6169蛋白;小鼠免疫蛋白制备多克隆抗血清;Western blotting鉴定抗血清特异性与效价;酶联免疫法体外模拟AH6169抗血清与重要水产病原菌的相互识别作用。结果表明,AH6169属跨膜蛋白,无规则卷曲占全序列46.79%,延伸25.49%,α-螺旋22.69%;不同种类的气单胞菌AH6169蛋白保守性较高;成功构建AH6169表达菌株,最佳表达条件为诱导时菌液浓度OD_(600)=0.8,IPTG浓度0.1 mmol·L~(-1),32℃诱导8 h;纯化获得AH6169蛋白,制备的AH6169小鼠抗血清具有较好的特异性,且效价达到1∶1 600;AH6169蛋白抗血清与嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌和溶藻弧菌存在相互识别作用。说明AH6169蛋白有较好的抗原性,AH6169可为不同种类的气单胞菌提供交叉免疫保护作用,并且其细胞表位较为丰富,可能是一种潜在的疫苗候选成分。     

新型免疫分子TRIM23参与斑马鱼 抗嗜水气单胞菌免疫应答

为获得纯化的斑马鱼TRIM23(tripartite motif 23)重组蛋白并研究其免疫功能,试验采用逆转录PCR(RT-PCR)技术扩增TRIM23全长序列,将其与原核表达载体pGEX-4T-1连接并转化至E.coli Rosetta感受态细胞,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用谷胱甘肽巯基转移酶(GST)蛋白纯化介质纯化目的蛋白后,将其与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)孵育,检测抑菌活性。结果显示,重组表达载体pGEX-TRIM23在宿主菌Rosetta中表达出约91 ku的重组蛋白,且蛋白部分以可溶形式存在于上清中,经体外抑菌试验检测发现,TRIM23蛋白能够抑制嗜水气单胞菌的增殖。基于以上研究,推测TRIM23在斑马鱼抗细菌免疫应答过程中发挥作用。     

保护地蔬菜病虫害发生特点及其综合防治

根据保护地蔬菜病虫害发生特点,掌握综合防治方法,把病虫为害损失控制在经济允许水平之下,达到优质、高产、低成本和农产品无污染的目的。     

加拿大的农业科技及其组织管理

本文详细介绍了加拿大农业科技体制改革及其组织,其总的研究发展方向由加拿大政府掌握.把科技政策、研究发展方向和国家需要结合起来通盘考虑,自上而下提出科研项目.     

高校思想政治教育与创新创业教育的双向构建

高校顺应社会经济发展要求,越来越重视思想政治教育与创新创业教育的融合。分析了思想政治教育与创新创业教育的互动关系,阐述了思想政治教育与创新创业教育双向构建优势,提出了构建的对策:教育理念层面实现互相融合、教学内容层面实现丰富升华、实践活动层面实现有机结合和组织管理层面实现系统完备。     

隰县河沟流域水土流失及其防治对策

在综合调查的基础上,分析了隰县河沟流域水土流失形式、分布、危害及其形成原因,并据此提出了调整土地利用结构,加强基本农田建设,适当发展果树和经济林、建立生物和工程相结合的水土流失综合控制体系,为建设高产、优质、高效农业提供保障,积极发展多种经营,重视庭院经济及聚落周围经济建设的研究,加快水土流失综合治理步伐。     

Induction and survival of hemoglobin-less and erythrocyte-less tadpoles and young bullfrogs

Injection of two 25-microgram-per-gram doses of the hemolytic agent phenylhydrazine reduced the hemoglobin level and the erythrocyte count to less than 1 percent of normal tadpole and young blullfrog blood. These anemic animals survive for weeks with little change in overall metabolism. A slow recovery of hemoglobin levels was observed. The implications of this observation for comparative biochemistry are considered.     

牡蛎的营养保健功能及其开发利用

介绍了牡蛎的营养价值、保健功能和产品开发利用的现状,并分析了牡蛎产品开发的前景及存在的问题。     

秦汉时期的中印交通与农业科技文化交流

对秦汉时期中国与印度的交流进行考证,在丰富的史料基础上,研究了当时中印的交通状况与农业科技文化交流。     

论现代农业,农业科技发展与高校教学和科研组织

本在论述世界家业发展的三个阶段和现代农业科学技术特点及其对农业人才素质要求的基础上,提出了高等农业教育应当处理好专与博关系、两络与教师关系、外在知识系统性与内在思维创造性关系,指出了在学校管理中,应当逐步克服传统弊端,哿横向管理力度。     

猪传染性胸膜肺炎病原分离鉴定及防治试验

从发病猪的肺脏分离到1株细菌,经形态学检查、生化实验、卫星生长现象、溶血试验、动物实验证明该分离菌为胸膜肺炎放线杆菌,用该分离菌研制出自家灭活苗,预防效果良好,用康复猪制备自家血清同时配合敏感抗菌素使用,治疗效果良好.