枸杞甜菜碱醛脱氢酶基因全长cDNA的克隆与表达分析

根据GenBank中的植物甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的同源保守区设计简并引物,采用RT-PCR技术从枸杞中扩增出BADH基因的部分保守序列,并利用巢式PCR、5′-RACE和3′-RACE获得BADH基因的全长cDNA。测序结果表明:BADH全长为1 869 bp,包含1 512 bp长的开放读码框(ORF),编码1个含503个氨基酸残基、分子质量为55.12 ku、等电点(PI)为5.19,包括醛脱氢酶高度保守序列VTLELGGKSP和其后287 bp处与酶功能有关的Cys的假定蛋白质。mRNA分析表明:BADH基因在枸杞幼苗组织中受高盐胁迫和低温胁迫的上调诱导表达,表明该基因可能在植物抵御非生物胁迫中发挥重要作用。     

盐芥ThNHX1基因的克隆及序列分析

为研究盐生植物的耐盐机理,根据拟南芥的序列设计引物,通过RT-PCR及RACE的方法从盐生植物盐芥中克隆出一个假定的Na /H 逆向转运蛋白基因ThNHX1.该cDNA全长2 045 bp,开放读码框长度为1 638 bp,编码一个545个氨基酸的多肽.序列分析结果表明,该序列与拟南芥的Na /H 逆向转运蛋白基因具有很高的同源性.结构分析结果表明,ThNHX1基因与AtNHX1基因具有类似的外显子和内含子构成.系统发育分析结果表明,该蛋白与液泡型的Na /H 逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型的Na /H 逆向转运蛋白亲缘关系较远.     

翅碱蓬脱水素基因克隆及表达载体构建

【目的】克隆翅碱蓬脱水素蛋白基因并构建其植物表达载体,为其耐盐性研究奠定基础。【方法】提取翅碱蓬总RNA,通过同源克隆和RACE方法分离获得翅碱蓬脱水素蛋白基因,并构建该基因的植物表达载体pBI121-DHN。【结果】克隆获得翅碱蓬脱水素蛋白基因的全长cDNA为847bp（GenBank序列编号：KC013239）,命名为SsDHN。序列分析结果表明,SsDHN全长cDNA中5＇-UTR为61bp,ORF为678bp,3＇-UTR为108bp且包含29bp的poly（A）尾巴,其起始密码子ATG位于62bp处,终止密码子TAA位于737bp处,编码225个氨基酸。氨基酸比对结果表明,该基因推导的氨基酸与已知其他植物DHN基因序列有35%～48%的相似性。聚类分析结果显示,翅碱蓬（SsDHN）与拟南芥和荠菜DHN亲缘关系较近,与咖啡、杜鹃花的亲缘关系较远。【结论】成功克隆了翅碱蓬脱水素基因,并构建了其表达载体,可用于翅碱蓬抗盐的遗传改良。     

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.     

甘蔗DⅢ家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSDⅢ克隆及其hpRNA载体构建

[目的]克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建其hpRNA表达载体,为研究该基因生物学功能奠定基础.[方法]通过同源克隆获得甘蔗SofSPSDⅢ基因部分序列,利用RACE技术获得其全长cDNA.扩增SofSPSDⅢ目的基因约500 bp序列,利用中间载体pHANNIBAL构建该片段的hpRNA结构,然后用NotⅠ将整个hpRNA结构切下,克隆到双元植物表达载体pART27上,构建该基因的hpRNA表达载体.[结果]通过同源克隆和RACE技术获得SofSPSDⅢ基因全长cDNA序列,该基因全长3252 bp,5 ＇端UTR长度59 bp,3 ＇端UTR长度292 bp,开放阅读框（ORF）长度2895 bp,带有真核生物典型的poly（A）尾巴（GenBank登录号：HQ117935）.该基因编码蛋白含有964个氨基酸,理论分子量108.03kDa,等电点pI=6.66;SofSPSDⅢ与SoSPS2、SbSPS和TaSPS9的氨基酸序列同源性分别为99.0％、98.9％和90.0％.构建获得SofSPSDⅢ基因的hpRNA载体pART-DⅢ-Ri.[结论]成功克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建基hpRNA载体,可为下一步沉默该基因、进而解析该基因的生物学功能奠定基础.     

互花米草BADH基因的克隆与定量表达分析

为研究甜菜碱醛脱氢酶(Bataine aldehyde dehydrogenase,BADH)基因的耐逆功能及分子机制,以盐生植物互花米草(Spartina alterniflora)为试验材料,利用RACE技术克隆了cDNA全长序列。生物信息学分析发现,该核苷酸序列全长1 983 bp,开放阅读框1 515 bp,编码504个氨基酸残基。Blast比对发现,该氨基酸与细叶结缕草、二穗短柄草、高粱氨基酸的相似性分别达到96%、87%、86%,且氨基酸数量基本相同。将该基因命名为Sa BADH。以tub为内参,对SaBADH基因在600 mmol/L的NaCl、20%的PEG处理下表达的定量分析表明,SaBADH受NaCl、PEG诱导表达,随着处理时间的延长,SaBADH基因的表达呈现先上升后下降的趋势,分别在处理24、12 h时达到最大值,分别约为对照的7、4倍,差异达到极显著水平,表明SaBADH基因可能在抵御盐和干旱对互花米草的胁迫中发挥重要作用。     

盐角草PsaH基因的克隆及生物信息学分析

【目的】从盐生植物盐角草(Salicornia europaea)中克隆得到一个参与光合反应光系统I(PSI)复合蛋白H亚基的Psa H基因,分析该基因进行生物信息学,为研究该基因的作用奠定基础并为改良作物耐盐性分子育种提供候选基因。【方法】以盐生植物盐角草为实验材料,采用RT-PCR方法克隆Psa H基因,利用NCBI、MEGA、Expasy等生物信息学工具对其核酸序列、编码的氨基酸序列及蛋白质的结构和功能进行分析。【结果】克隆得到一个与耐盐有关的基因,命名为Se Psa H,属于光系统I(PSI)家族H亚基成员,其开放阅读框(ORF)为438 bp,基因编码145个氨基酸,预测蛋白分子量为15.3 k D,等电点9.84,是亲水性蛋白;系统进化树分析表明其与菠菜亲缘关系较近,通过对该蛋白保守性分析发现其含有4个保守性结构域。【结论】获得盐角草Se Psa H基因,为进一步研究该基因耐盐功能及其在盐生植物耐盐机制中的作用提供了基础。     

枸杞抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆与表达分析

为探索青海枸杞抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因信息,并对枸杞APX基因进行生物信息学分析以及基因表达研究,通过RT-PCR和RACE方法克隆枸杞APX基因,利用生物信息学软件预测基因结构,采用实时荧光定量PCR方法分析基因表达的变化。结果显示:枸杞APX基因的全长cDNA序列为1 047bp(Genbank No.KX981601),命名为LcAPX基因。该基因含有1个753bp的完整开放阅读框(ORF),编码250个氨基酸,包含亚铁血红素结合位点、底物结合位点和K~+结合位点。枸杞LcAPX与茄科植物的APX蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。LcAPX基因在枸杞的成熟叶中表达量最高,花中表达量最少。其在聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)胁迫下诱导表达,显示LcAPX在枸杞抗干旱和抗盐逆境过程起一定作用。     

盐地碱蓬PsaH基因的克隆及生物信息学分析

【目的】PsaH基因是编码光合反应光系统I(PSI)复合蛋白H亚基的基因。为深入开展该基因的耐盐功能研究及其在盐生植物耐盐机制中的作用提供了基础,并为改良作物耐盐性分子育种提供候选基因。【方法】研究从盐地碱蓬(Suaeda salsa)盐胁迫文库中筛选出一个与耐盐相关的PsaH基因,经测序获得全长cDNA序列,命名为SsPsaH(GeneBank Accession Number:KC4048847),对该基因进行生物信息学分析进行结构功能预测。【结果】该基因全长770 bp,开放阅读框(ORF)为438 bp,编码145个氨基酸;该基因所编码的蛋白定位于叶绿体膜系统,无信号肽,含有一个跨膜结构的亲水性不稳定蛋白,二级结构多为无规则卷曲。同时,该基因在不同物种间具有较强的保守性,含有4个高度保守的结构域,系统进化树分析表明,其与菠菜亲缘关系最近。RT-PCR分析表明,SsPsaH基因在根、茎、叶中均有表达,但在茎和叶中表达量高于根。【结论】SsPsaH基因是编码光合反应光系统I(PSI)复合蛋白H亚基的基因。本研究为以后深入开展该基因的耐盐功能研究及其在盐生植物耐盐机制中的作用提供了理论基础。     

四翅滨藜BADH基因的克隆、序列分析及其原核表达

在构建四翅滨藜(Atriplex canescens)全长cDNA文库中通过随机克隆测序并进行EST分析基础上,得到1个四翅滨藜甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)的cDNA序列,命名为AcBADH。AcBADH cDNA包含1个长度为1 500 bp的完整开放阅读框,编码500个氨基酸,属于ALDH-SF超家族,其核酸序列与中亚滨藜的BADH基因的同源性为98%,对应编码氨基酸序列同源性为99%。将得到的序列提交GenBank(登录号:JF776157)。与其他植物BADH的氨基酸序列比对,AcBADH具有相同功能区域,包括N-端信号肽,底物结合及酶催化位点,因而推测可以参与甜菜碱的合成反应。对AcBADH与其他植物BADH的氨基酸序列的进化分析表明,AcBADH与鞑靼滨藜、中亚滨藜的亲缘关系较近。将AcBADH基因与原核表达载体pET28a连接,进行融合表达,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出分子质量约58 kD的蛋白。     

三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因的cDNA序列克隆与表达分析

[目的]研究三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化。[方法]通过RACE技术,以我国重要的淡水珍珠贝——三角帆蚌为研究客体,克隆了CaM的cDNA全长,并通过Real-Time Q-PCR技术分析了该基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化。[结果]三角帆蚌CaM基因cDNA全长659bp,包括70 bp的5'UTR,299 bp的3'UTR和447 bp的ORF,编码149个氨基酸,预测其分子量为16.8 kDa,等电点为4.14。cDNA序列比对信息表明三角帆蚌与池蝶蚌、合浦珠母贝间均具有57%的相似度,而其蛋白具有高度的保守性,除斑马鱼外,各生物CaM相似率达97%。定量数据表明,CaM基因广泛表达于三角帆蚌各组织,外套膜内膜与腮中表达量显著升高(P0.05),其次是外套膜外膜和内脏团组织。插核育珠能增加该基因在各组织的表达,特别是在外套膜外膜和鳃组织中,育珠蚌该基因的表达显著高于非育珠蚌(P0.05)。此外,水体Ca2+浓度的增大对CaM基因表达有显著的影响,外套膜内膜该基因的表达随Ca2+浓度升高而增加,而外套膜外膜1.25 mmol/L Ca2+浓度下该基因的表达水平显著高于0.50 mmol/L、3.00 mmol/L组(P0.05)。[结论]为进一步深入研究钙调蛋白基因的在珍珠生长过程中的功能及其调控机理奠定了分子基础。     

百合单萜合成酶基因的克隆与序列分析

单萜化合物是‘西伯利亚’百合花香的主要成分,为了研究百合单萜化合物的合成与代谢机理,以百合的花瓣为材料,根据GenBank发表的单萜合成酶基因的保守区设计1对简并引物,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,克隆得到一个单萜合成酶基因的cDNA序列,命名为Li-mTPS2。该基因全长为1 766bp,包含1 608bp的基因开放阅读框(ORF),45bp的5′UTR和113bp的3′UTR,编码535个氨基酸,含有萜烯合成酶(TPS)保守序列DDxxD以及TPSb亚家族共有的RRx8W基序。氨基酸同源性分析表明该基因所编码蛋白的氨基酸序列与小苍兰芳樟醇合成酶、姜花单萜合成酶、六出花月桂烯合成酶的同源性分别为55%,53%,51%。     

绒山羊RORα基因2种亚型的结构与进化分析

为深入研究绒山羊RORα基因的结构及功能,利用cDNA末端快速扩增法（RACE）结合转录组获得了绒山羊（Capra hircus）维甲酸相关孤核受体（retinoic acid receptor-related orphan receptorα,RORα）基因的2个亚型:RORα1和RORα2（GenBank登录号分别是HM₀61155和HM₃58053）。序列分析表明,RORα1序列全长1 620bp,包括5′端非翻译区（untranslated region,UTR）29bp、3′端非翻译区211bp和开放阅读框（open reading frame,ORF）1 380bp,共编码459个氨基酸,分子质量约为52.3ku,理论等电点6.25。RORα2序列全长1 694bp,包括5′UTR 76bp、3′UTR 211bp和ORF 1 407bp,共编码468个氨基酸;与人RORα4的长度相同,相似性达99%,分子质量约为53.4ku,理论等电点为6.37。结果显示:1)RORα1氨基酸序列缺少大多数核受体具有的调节区（A/B区）,预测的二级结构少一个β-折叠基序（YFV）;2)RORα的DNA结合区到配体结合区部分属于纯化选择,A/B区在长度和序列方面变异都很大。     

橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因HbCP2的克隆与表达特性分析

根据EST和基因组序列设计引物,应用RT-PCR技术从橡胶树的根组织中分离到1条长1056 bp的cDNA,该序列包含了1023 bp的开放读码框（ORF）,17 bp的5’UTR和16 bp的3’UTR;ORF预测编码340个氨基酸,理论分子量为37.52 kD,等电点为5.25,属于液泡定位的分泌型蛋白;蛋白含有1个Inhibitor_I29和1个Peptidase_C1A结构域,隶属于木瓜蛋白酶C1家族;蛋白与蓖麻、杨树中同源蛋白的相似性均在80％以上,将基因命名为Hb CP2。表达分析显示,在所分析的根、树皮、木质部、芽、叶片、叶柄和乳管等组织中,HbCP2仅在根中被检测到,表现出明显的组织特异性。     

橡胶死皮相关液泡型水通道蛋白基因TIP1的克隆与序列分析

[目的]死皮是指橡胶树（Hevea brasiliensis）产排胶过程中出现的一种割线症状,它会造成橡胶减产甚至完全绝收.研究对一死皮相关的水通道蛋白（Aquaporin,AQP）基因进行克隆和序列分析,以探讨AQP在死皮发生过程中的作用.[方法]基于一条在死皮植株中下调表达的EST,研究采用电子克隆和RT-PCR相结合的方法从橡胶树的树皮中扩增出HbTIP1 774 bp的cDNA,在此基础上采用生物信息学对基因的序列特征、编码蛋白的理化特性及进化关系进行了分析.[结果]该cDNA包含759 bp的ORF、8 bp的5＇UTR和7bp的3＇ UTR;基因预测编码252个氨基酸,理论分子量为25.88 kD,等电点为4.96.生物信息学分析显示,HbTIP1含有1个保守的MIP结构域,6个跨膜螺旋,液泡膜定位,可归为水通道蛋白（Aquaporin,AQP）家族TIP亚族.同源分析显示,Hb TIP1与可可（Theobroma cacao）、人参（Prunus persica）、橙子（Citrus sinensis）和蓖麻（Ricinus communis）中同源蛋白的相似性都在90％以上,显示出高度的保守性.[结论]该研究为下一步揭示AQP调控死皮发生机制创造了条件.     

川西高原黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C基因cDNA的克隆及序列分析（摘要）

[目的]为研究以鼠兔LDH-C4为靶蛋白的节育型鼠药奠定基础。[方法]黑唇鼠兔属于兔形目,鼠兔属,在GenBank数据库里没有兔形目物种LDH-C基因的相关序列,故采用设计简并引物的方法进行克隆。设计的3条简并引物序列为：D-Ps：5′-atgtcmacygtcaaggagcagct-3′：D-Pa1：5′-gcagayacabtgtaatcttttcc-3′;D-Pa2：5′-ttacarccacttccratyac-3′。用反转录生成的cDNA作为模板,采用巢式PCR法克隆LDH-C基因的EST,再根据EST序列设计了2条基因特异引物,采用3′RACE技术克隆LDH-C基因的3′端,2条基因特异引物为Pika-Ps1：5-cttgcccttgttgatgttgcaga-3和Pika-Ps2：5-ggatcttcaacatggcagtct-3。核酸序列的分析、拼接和相似性搜索采用Vector NTI Suite 9软件,系统发生树的构建用Mega 4.0软件,采用邻接法。[结果]黑唇鼠兔的LDH-C基因的cDNA全长1 498 bp,其中ORF长996 bp,编码332个氨基酸,3′UTR长486 bp。ORF序列比对显示LDH-C基因在大的分类单位上均很保守。系统树分析显示黑唇鼠兔的LDH-C基因和灵长类及偶蹄目的遗传距离较近,和啮齿目较远。[结论]成功的克隆得到了黑唇鼠兔的LDH-C基因的cDNA序列。     

奶牛OLR1 3′UTR A223C多态的生物学信息分析

[目的]探索氧化型低密度脂蛋白受体OLR13′UTR A223C多态与奶牛乳脂率高低紧密关联的分子机制。[方法]用miRanda（1.0）软件装载牛microRNA数据库,预测OLR13′UTR潜在的microRNA。[结果]共预测16个microRNA靶标,OLR13′UTRA223C突变定位于bta-miR-370靶标种子序列的互补区。[结论]由于OLR13′UTRA→C突变导致bta-miR-370靶标的消失,为OLR13′UTR A223C多态与奶牛乳脂率高低紧密关联的分子机制深入研究提供依据。     

日本蟾蜍皮肤胸腺素α原cDNA的克隆及序列分析

为研究蟾酥、蟾衣、蟾皮中多肽类有效成分,通过菌落聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）对日本蟾蜍Bufo japonicus formosus皮肤cDNA质粒文库进行了筛选,获得胸腺素原（prothymosin?鄄,ProT）全长cDNA序列,并对它们进行了生物信息学分析。日本蟾蜍ProT cDNA全长为1 480 bp,包括339 bp的完整开放阅读框（open reading frame,ORF）,5端125 bp及3端1 016 bp的非翻译区（untranslated region,UTR）。根据cDNA序列推导的日本蟾蜍ProT由112个氨基酸残基组成,无信号肽结构。氨基酸序列同源性分析显示,日本蟾蜍ProT与食用蛙Rana esculenta同源性为82%,与其他11种动物的同源性则介于54%～73%。ProT具有显著的抗肿瘤作用。分析日本蟾蜍ProT cDNA序列,可为研究其生物学功能和药物研发提供实验依据。图4参17