遗传与营养因素对猪LDLR与SCD基因表达的影响

研究通过荧光定量PCR方法对不同蛋白质营养水平下宁乡猪和杜长大猪大脑、小脑、背肌、皮脂、回肠、肝和肾7个组织中的LDLR和SCD基因的表达进行检测,结果表明:①品种因素对LDLR基因在回肠和肝中的表达有显著影响,DLY猪中的表达量显著高于在宁乡猪中;日粮因素对LDLR在回肠中的表达影响显著.②品种因素和日粮因素对SCD基因的表达都没有显著影响.     

利用CRISPR/Cas9技术构建猪的LDLR基因敲除细胞

利用CRISPR/Cas9系统构建猪的低密度脂蛋白受体基因LDLR敲除细胞：根据NCBI数据库猪LDLR基因(Gene ID为396801)序列设计sg RNA靶位点，构建敲除打靶载体，通过电转染猪胎儿成纤维细胞，经G418筛选获得细胞克隆，进行PCR扩增和T载体克隆测序，经序列比对计算基因敲除效率。结果表明，依照CRISPR/Cas9系统GN20GG法则，在LDLR基因第一外显子上设计1条sg RNA，测序结果显示靶序列已正确连接，转染、筛选后共获得30个单细胞克隆，23个测序成功，其中有7个细胞克隆为LDLR基因敲除细胞克隆，敲除效率为30.4%。     

低密度脂蛋白受体基因表达调控研究

低密度脂蛋白受体(LDLR)调节体内胆固醇的平衡是通过其启动区的固醇调节元件(SRE)感受体内胆固醇的变化,从而调控LDLR基因的表达来实现的。胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)、SREBP裂解蛋白(SCAP)参与这一调节。LDLR基因的表达还受到HMG-CoA还原酶抑制剂、激素、细胞生长因子等因素的影响。     

PCSK9基因D374Y突变体转基因猪的制备与分析

【目的】前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/Kexin type 9,PCSK9)基因是人类高胆固醇血症(autosomal dominant hypercholesterolemia,ADH)的主效基因之一,其获得型突变与人类家族性高胆固醇血症有直接的关系。PCSK9-D374Y突变体对低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)的降解能力比野生型蛋白强十倍,增加了患高胆固醇血症的风险,从而加速动脉粥样硬化的进程。猪心血管系统和血脂代谢方面与人类非常相近,成为研究动脉粥样硬化疾病的理想模型之一。然而自然发病的猪缺乏,且诱导病征发生缓慢。因此拟利用体细胞克隆技术制备PCSK9获得型突变体转基因猪,以模拟动脉血管的病理学变化,加速发病进程,为动脉粥样硬化的研究提供理想的动物模型。【方法】研究使用人PCSK9基因D374Y突变体载体,用电转染的方法将其整合到五指山小型猪近交系胎儿成纤维细胞中,并通过体细胞核移植技术获得了人PCSK9基因D374Y突变体转基因猪个体。通过Southern-blot、实时荧光定量PCR、Western-blot等方法,分别从DNA、RNA、蛋白的水平检测了人PCSK9基因在转基因猪肝脏中的整合表达情况。同时,通过组织化学染色与H.E.染色的方法对转基因猪进行了组织学检测。【结果】转基因阳性细胞集落在药筛的第3天开始出现,至第7天形成较大的单克隆点,且PCR检测结果显示扩增产物可以拼接为完整片段,说明外源片段在基因组中具有完整性;将筛选得到的阳性细胞作为体细胞克隆的供体细胞,通过体细胞核移植技术获得了转基因猪个体。PCR及Southern-blot检测结果显示,D374Y-PCSK9基因可以完整的插入猪的基因组中,且有串联重复现象;RT-PCR和QPCR检测结果表明,人PCSK9基因能在猪肝脏内正常转录且不影响猪内源性PCSK9基因的转录,且在其它内脏器官,如心、脾、肺、肾也能检测人PCSK9基因的表达,而猪内源性PCSK9基因在这些组织中表达量很低;Western-blot检测结果与RNA水平的检测类似。这些结果说明人D374Y-PCSK9基因成功整合到猪基因猪中,且能够正常转录与翻译。通过组织化学染色发现,与野生型猪肝脏相比,克隆猪肝脏中LDLR蛋白水平极显著低于野生型。另外,对克隆猪进行H.E.染色后发现其肝脏组织有明显的病理学变化,该结果说明,LDLR水平的急剧下降有可能是导致肝脏病变的原因。【结论】成功获得了人PCSK9基因D374Y突变体的克隆猪;与野生型猪肝脏相比,克隆猪肝脏中LDLR水平显著降低,并且克隆猪肝脏发生了明显病变。     

基于RNA-seq技术筛选山羊卵泡发育相关下调基因

【目的】对山羊优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF)颗粒细胞进行高通量测序,筛选并研究与山羊卵泡发育相关的下调基因。【方法】以1岁龄贵州白山羊为供试对象,在其发情3 d后,采集第一卵泡波中的优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF),分别分离其颗粒细胞,提取RNA并进行文库构建、Illumina测序,将获得的序列与山羊的RefSeq数据库进行比对后,用DESeq2软件对获得的RNA进行差异表达分析,并对表达下调的基因进行GO分析和KEGG信号通路分析,最后通过Real-time PCR对筛选出的表达下调基因进行验证。【结果】将测序结果与山羊的RefSeq数据库比对后,共获得了33 896个基因。经DESeq2软件对获得的mRNA进行差异表达分析,共获得695个差异表达m-RNA,其中462个表达显著下调,233个表达则显著上调;对462个表达下调基因进行GO分析,共分为2大类39组,其中参与生物学过程(BP)的基因占48.7%;与细胞组分(CC)有关的基因占51.3%。KEGG信号通路分析发现20条通路,其中参与癌症通路基因富集最为显著。从下调基因中筛选出6个可能会抑制山羊卵泡发育的基因,分别为PTX3、LDLR、RGN、NID1、PDLIM5、PRLR。Real-time PCR结果显示,RGN、NID1、PDLIM5、PRLR在SF与DF中的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在SF颗粒细胞中的表达量极显著高于DF(P0.01),NID1、PDLIM5在SF颗粒细胞中的表达量显著高于DF(P0.05);PTX3、LDLR在SF与DF中表达量与高通量测序结果相反。【结论】获得的6个表达下调基因在山羊卵泡发育过程中可能会抑制卵泡的发育,最终导致卵泡闭锁。     

小尾寒羊血液蛋白多态性与多羔性研究

通过非连续性垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对小尾寒羊的8种血液蛋白(酶)进行多态性检测,同时以甘肃藏羊作为对照,探索绵羊多羔性与血液生化遗传的相关性。结果表明:Hb位点的HbB基因、Tf位点的TfC基因、Es的Es-基因与绵羊多羔性可能存在相关性,Ep是否可以作为小尾寒羊多羔性的遗传标记,还需进一步探讨,其它4个蛋白(酶)AIb、Pr、AMY、LDH与绵羊多羔性不相关;同时得出与多羔性相关的蛋白位点基因与目前所研究的多胎基因FecB等主效基因均不连锁,但存在相关性。     

鸡钙蛋白酶及其基因的分子生物学研究进展

钙蛋白酶是与肉质性紧密相关的一个候选基因,对鸡的钙蛋白酶及相关基因的分子生物特性及其与一些性状的相关性的研究进展进行了综述。     

牡蛎中细菌及其抗性基因多样性分析

牡蛎作为一种滤食性双壳类海洋生物,受生活习性影响,容易富集微生物。本研究以中国四个沿海地区所产牡蛎为研究对象,分析了不同样品中微生物多样性以及肠道、腮和肌肉三种组织器官中抗生素及重金属抗性基因分布情况及分布规律,最后采用相关性分析比较了抗性基因之间的相关性。结果表明：(1)微生物含量占比前5位的细菌分别为：多形拟杆菌、芽孢杆菌、假单胞菌、河流弧菌及嗜盐杆菌斯氏弓形菌,包含了两类腐败菌属和一类致病菌属;(2)从抗性基因种类来看：氨基糖苷类ARGs检出率最高(84.1%),β-内酰胺类ARGs和喹诺酮类ARGs检出率最低(57.1%);以牡蛎不同组织器官分析抗性基因：肌肉中检出率(65.6%)＞腮中检出率(59.1%)＞肠道中检出率(58.4%);以不同样品来源分析抗性基因检出率：GXBH样品整体检出率最高(72.7%),SDWH1整体检出率最低(54.5%),不同来源样品在抗性基因种类及丰度上各样品差异不显著,在进行PCA分析后发现同一样品可以进行明显的归一化分类,说明同一样品不同组织器官中抗性基因关联性较大;(3)从不同抗性基因ARGs和HTGs的相关性分析来看,CARB和qnrS相关性最高,ChrR则与sulA和mecA有较大相关性,CopA与各大类ARGs都有一定相关性,说明不同类型抗性基因有存在共用一个基因盒的可能性,从对不同来源样品的相关性分析来看,基本遵循了以不同产地样品进行归一化的分类,说明养殖环境可以对牡蛎中抗性基因的分布产生影响。通过以上研究,分析了牡蛎中微生物优势菌群,初步比较了抗性基因与品种、产地、各组织器官之间的相关性,为进一步研究抗性产生机制打下了基础。     

GCLM基因与迟发性运动障碍的关联性分析

采用PCR-RPLC法对样本基因组进行扩增与酶切,用UNPASED3.0对GCLM基因位点基因型和等位基因进行卡方检验,结果显示GCLM基因位点的等位基因和基因型均与迟发性运动障碍的病症无明显相关性。     

奶牛HSP70基因多态性与生产性能的关系

采用PCR-SSCP方法,对娟姗牛和荷斯坦奶牛HSP70基因5′-侧翼区多态性进行了检测。结果初步显示:A基因可能为抗热应激基因,AB型个体的生产性能与BB型个体差异不显著,耐热性能与生产性能的相关性可能不大。     

Autosomal recessive hypercholesterolemia caused by mutations in a putative LDL receptor adaptor protein

Atherogenic low density lipoproteins are cleared from the circulation by hepatic low density lipoprotein receptors (LDLR). Two inherited forms of hypercholesterolemia result from loss of LDLR activity: autosomal dominant familial hypercholesterolemia (FH), caused by mutations in the LDLR gene, and autosomal recessive hypercholesterolemia (ARH), of unknown etiology. Here we map the ARH locus to an approximately 1-centimorgan interval on chromosome 1p35 and identify six mutations in a gene encoding a putative adaptor protein (ARH). ARH contains a phosphotyrosine binding (PTB) domain, which in other proteins binds NPXY motifs in the cytoplasmic tails of cell-surface receptors, including the LDLR. ARH appears to have a tissue-specific role in LDLR function, as it is required in liver but not in fibroblasts.     

不同药物对动脉粥样硬化兔体内两种受体表达的影响

为了给药物的筛选和利用提供基础数据,用手术法切除新西兰雌兔双侧卵巢,用高胆固醇饮食法制备动脉粥样硬化模型。利用实时荧光定量RT-PCR方法,对动脉粥样硬化兔心脏和肝脏内ER mRNA和LDLRmRNA的表达进行了分析。研究表明,ERα在模型组(C)、假手术组(SC)、正常饲料组(N)、利维爱组(TIB)、倍美力组(PRE)和新伐他汀组(SIM)心脏内的相对表达量分别为0.29、0.53、0.46、0.85、0.48、0.30,在肝脏内的相对表达量分别为0.32、0.51、0.49、0.68、0.50、0.30;低密度脂蛋白受体(LDLR)在模型组(C)、假手术组(SC)、正常饲料组(N)、利维爱组(TIB)、倍美力组(PRE)和新伐他汀组(SIM)心脏内的相对表达量分别为0.22、0.24、0.33、0.27、0.31、0.23,在肝脏内的表达量分别为0.86、0.93、1.52、1.27、1.19、0.88。结果显示,利维爱通过增加心脏和肝脏内雌激素受体、低密度脂蛋白受体的表达发挥抗动脉粥样硬化的作用。新伐他汀可以有效的防治动脉粥样硬化的发展,对心脏和肝脏内的2种受体的表达没有影响。倍美力防治AS的效果不明显,可以促进ERα和LDLR在心脏和肝脏内的表达。     

猪肉品质候选基因研究进展

肉品质性状改良是当今遗传育种界的研究热点之一。利用候选基因策略寻找影响肉质性状的主效基因,从而应用于猪的肉质改良,从分子遗传学角度来说是可行的。综述了与猪肉品质有关的基因:氟烷敏感基因(Hal)、猪酸肉基因(RN)、心脏脂肪酸结合蛋白基因(H-FABP)、激素敏感脂肪酶基因(HSL)和脂蛋白脂肪酶基因(LPL)的研究进展。     

油脂来源及使用量对小鼠生长、健康、血脂和肝脏胆固醇代谢指标的影响

【目的】观察饲料中添加不同种类和不同剂量的油脂对小鼠生长性能、健康状态、血脂指标和肝脏胆固醇代谢关键基因相对表达量的影响,探讨日粮中不同油脂来源及使用量对肝脏胆固醇代谢的作用机制,为哺乳动物筛选较为适宜的油脂类型及其添加量提供理论参考。【方法】试验选取3周龄体重16-19 g的健康昆明种小鼠48只,随机分为4组,每组4个重复,每个重复3只。4组分别饲喂正常小鼠饲料（对照组）和添加4%豆油（B组）、4%乳化椰子粉（L组）以及8%乳化椰子粉（H组）的饲料14 d。试验期间,记录每天的饲喂次数、每次饲喂量、饲料剩余量,所有试验动物均自由采食和饮水。分析试验期间小鼠的体重变化和平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）以及料重比（F/G）等生长性能指标,分析小鼠的血液分布和健康指数等健康状态指标,测定小鼠的肝脏重以及甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等血清脂质指标,运用实时荧光定量PCR技术检测小鼠肝脏组织中胆固醇7-α羟化酶（CYP7A1）、低密度脂蛋白受体（LDLR）和3-羟-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGCR）这3个基因的mRNA表达水平。【结果】①生长性能方面,添加4%豆油组的小鼠体重变化、平均日采食量和肝脏脏器指数与对照组差异显著（P＜0.05）,而平均日增重、料重比和肝脏重与对照组差异不显著（P＞0.05）;添加4%乳化椰子粉组的小鼠各生长性能指标与对照组差异不显著（P＞0.05）;8%乳化椰子粉显著提高小鼠的平均日采食量（P＜0.05）,其他指标差异不显著（P＞0.05）。②健康状态方面,各试验组小鼠的血液分布和健康指数与对照组相比均无显著性差异（P＞0.05）。③血脂指标方面,与对照组相比,添加4%豆油显著降低了小鼠血清中TC和HDL-C含量（P＜0.05）,对TG和LDL-C的影响差异不显著（P＞0.05）,添加4%乳化椰子粉对小鼠的各项血脂指标均无显著性影响（P＞0.05）,添加8%乳化椰子粉能显著降低血清TC含量（P＜0.05）,但对TG、HDL-C和LDL-C无显著性影响（P＞0.05）;④肝脏胆固醇相关基因方面,添加8%乳化椰子粉组肝脏中CYP7A1基因mRNA表达量显著高于对照组（P＜0.05）,而4%豆油组和4%乳化椰子粉组与对照组相比无显著差异（P＞0.05）。肝脏HMGCR基因和LDLR基因mRNA表达水平与对照组差异不显著（P＞0.05）。【结论】日粮中添加豆油增加了小鼠日采食量和体重等指标,降低了血清总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇;高剂量乳化椰子粉的添加提高了小鼠日采食量,降低了血清总胆固醇,并增加了肝脏CYP7A1基因mRNA的表达。相比于添加高剂量乳化椰子粉,低剂量乳化椰子粉在改善小鼠脂代谢方面应用效果并不好。添加油脂可能是通过调控肝脏中胆固醇代谢相关酶的基因表达量来影响小鼠肝脏胆固醇的代谢,从而维持体内的胆固醇代谢的稳态。     

极低密度脂蛋白受体的研究

极低密度脂蛋白受体(VLDL-R)是一种存在细胞表面的、可识别多种配体的跨膜蛋白,是含有载脂蛋白E(ApoE)的脂蛋白颗粒的受体,在动物体内富含三酰甘油(TG)的脂蛋白的代谢中发挥重要作用。该受体在禽类机体内发挥着介导卵子发生发育的重要生理功能,在哺乳动物机体中主要是参与脂蛋白代谢,可能还有其他生理功能有待于进一步研究。就极低密度脂蛋白受体的分子结构、分布部位、生物学功能以及其基因序列作了简要综述。     

Human lipoprotein lipase complementary DNA sequence

Lipoprotein lipase is a key enzyme of lipid metabolism that acts to hydrolyze triglycerides, providing free fatty acids for cells and affecting the maturation of circulating lipoproteins. It has been proposed that the enzyme plays a role in the development of obesity and atherosclerosis. The human enzyme has been difficult to purify and its protein sequence was heretofore undetermined. A complementary DNA for human lipoprotein lipase that codes for a mature protein of 448 amino acids has now been cloned and sequenced. Analysis of the sequence indicates that human lipoprotein lipase, hepatic lipase, and pancreatic lipase are members of a gene family. Two distinct species of lipoprotein lipase messenger RNA that arise from alternative sites of 3'-terminal polyadenylation were detected in several different tissues.     

胆碱对鹅体内脂质代谢及肝脏FAS基因mRNA表达的影响

【目的】探讨胆碱对青农灰鹅体内脂质转运、代谢的作用及脂肪酸合成酶FAS（fatty acid synthase）基因表达的影响,确定鹅日粮中胆碱的最适添加量。【方法】将180只1日龄青农灰鹅随机分为6个处理组,每处理组3个重复,每个重复10只。试验在玉米-豆粕型饲粮的基础上各组的胆碱添加量分别为0、600、1 200、1 800、2 400和3 000 mg•kg-1,试验期15周。屠宰后测定肝脏和血清总胆固醇、甘油三酯,血清低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、葡萄糖、胰岛素、胰高血糖素水平,肝脏脂蛋白酯酶、肝脂酶及血清胆碱酯酶活性和肝脏脂肪酸合成酶（FAS）基因表达量。【结果】①4周龄时,饲粮中添加胆碱显著降低肝脏和血清总胆固醇、甘油三酯、血清低密度脂蛋白胆固醇、胰岛素水平和血清胆碱酯酶活性（P＜0.05或P＜0.01）;显著提高肝脏脂蛋白酯酶、肝脂酶活性和血清胰高血糖素水平（P＜0.05）;但对血清高密度脂蛋白胆固醇、葡萄糖含量影响不显著（P＞0.05）。15周龄时,饲粮中添加胆碱显著降低肝脏和血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇含量与胰岛素水平及血清胆碱酯酶活性（P＜0.05或P＜0.01）;显著提高肝脏脂蛋白酯酶、肝脂酶活性和血清高密度脂蛋白胆固醇、胰高血糖素水平（P＜0.05）;但对血清葡萄糖含量影响不显著（P＞0.05）。②饲粮中添加胆碱显著提高肝脏FAS基因的表达量（P＜0.01）,且肝脏脂肪酸合成酶基因表达量随胆碱添加水平呈先下降后上升趋势。【结论】综合考虑胆碱对鹅肝脏脂质代谢的影响,1—4和5—15周龄鹅饲粮中胆碱适宜添加量分别为1 200—1 800和1 200 mg•kg-1。