小麦控制籽粒大小基因功能研究取得新进展

<正>近日,西北农林科技大学生命科学学院赵惠贤教授团队在小麦控制籽粒大小基因克隆及功能研究方面中取得新进展:克隆得到位于小麦第7条同源群染色体短臂上CYP78A家族的新基因Ta CYP78A3;利用BSMV-VIGS技术沉默Ta CYP78A3基因在小麦籽粒中的表达,导致小麦种子大小降低11%(P0.01);通过转基因拟南芥过表达Ta CYP78A3基因,导致拟南芥种子增大11%~47%(P0.01)。进一步的细胞学观察和分子水平检测,揭示了小麦     

过量表达小麦TaCYP78A5增加花器官的大小

【目的】利用表达模式分析、转基因过表达和细胞学观察等策略,解析TaCYP78A5调控花器官大小的功能和机制,为作物遗传改良提供基因资源和理论基础。【方法】根据EnsemblPlants基因组数据库中不同物种CYP78A家族成员的序列信息,对小麦TaCYP78A5和其他物种中的同源基因进行序列比对和进化分析;利用生物信息学分析小麦TaCYP78A5的基因和蛋白结构,以及不同器官的表达模式;通过在拟南芥中组成型过表达和生殖器官局部特异性过表达TaCYP78A5的策略,明确TaCYP78A5具有调控花器官大小的功能;利用显微镜观察不同转基因拟南芥花器官的细胞学特征,解析TaCYP78A5调控花器官大小的细胞学机制;利用小麦转基因过表达策略,明确TaCYP78A5调控小麦穗部大小等其他穗部性状的功能;利用323份小麦品种的单倍型数据与穗部表型数据进行关联分析,探析不同小麦品种TaCYP78A5表达量的高低对穗部大小等其他穗部性状的影响。【结果】小麦TaCYP78A5与拟南芥AtCYP78A5的基因和蛋白序列相似性较低,但基因和蛋白结构相似性较高。小麦TaCYP78A5和拟南芥AtCYP78A5...     

棉铃虫细胞色素P450家族 CYP6AE14 基因克隆、序列分析及蛋白原核表达

采用同源克隆技术克隆石河子棉区棉铃虫抗性品系的P450家族解棉酚基因 CYP6AE14 。克隆获得的目的基因全长1 581 bp,编码526个氨基酸。序列分析表明,该抗性品系的 CYP6AE14 有1个氨基酸发生突变,即Y25F;其与烟草天蛾的CYP6AE32同源性较高,达60%。利用原核表达载体pET28 a在大肠杆菌中成功表达棉铃虫P450 CYP6AE14 基因,为进一步的基因功能验证奠定基础。     

双齿围沙蚕CYP4基因的克隆及序列分析

根据已知的绿沙蚕Nereisvirens细胞色素氧化酶CYP342A1保守区设计引物,采用RACE技术首次从双齿围沙蚕Perinereisaibuhitensis体壁肌肉中克隆出细胞色素氧化酶CYP4基因全长序列。分析结果表明,该序列全长为1857bp,5’端非翻译区为186bp,3’端非翻译区为225bp,阅读框为1446bp,编码为481个氨基酸。第422～431氨基酸序列符合P450所具有的结构保守共有序列FxxGxxxCxG,第319～322氨基酸序列为K螺旋特征基序ExxR区,第282～294氨基酸序列含有CYP4家族特征序列EVDTFMFEGHDTr。经Blast与GenBank中已知物种的氨基酸序列进行同源性比对,CYP4与多毛类绿沙蚕Nereisvirens CYP4BB1、CYP342A1（AY453408）氨基酸同源性为73％、36％,与多毛类小头虫CapiteUacapitataCYP4ATI（AY574044）同源性为39％。据此推断,双齿围沙蚕CYP4基因属于CYP4B亚家族。     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00 cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033 bp,其完整开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14 kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域;与大麦的亲缘关系最近,其次是与乌拉尔图小麦,与水稻最远。4)亚细胞定位结果表明,该基因定位在细胞核内。5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比,软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调,而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著;且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’(P<0.01)。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR与该基因表达量模式相似。综上,青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守;该基因定位在细胞核内,符合转录因子特性;HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR相似,在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。     

普通小麦和短柄草AGAMOUS LIKE 6基因RNA干扰载体的构建

AGL6(AGAMOUS LIKE6)基因亚家族是植物MADS-BOX基因家族一个古老的亚家族,近年的研究表明,禾本科植物玉米(Zea maize)AGL6基因ZAG3、水稻(Oryza sativa)AGL6基因OsMADS6参与调控花的发育。OsMADS6还影响种子的发育。普通小麦(Triticum aestivum)和短柄草(Brachypodium distachyon)中AGL6基因的功能还不清楚。为解析小麦和短柄草AGL6基因的功能奠定基础,运用RT-PCR等分子生物学方法,克隆TaAGL6基因的cDNA序列,构建RNA干扰载体,同时分析TaAGL6基因的表达模式。结果表明:成功构建TaAGL6和BdAGL6 RNA干扰载体,小麦中有3个同祖AGL6基因,分别位于A、B、D基因组上,它们除了在花序中高水平表达外,在幼苗的根中也有一定表达。     

桃PpCBF2基因克隆及其响应低温表达特性研究

为探讨桃品种间抗寒差异的分子基础,以野生毛桃(Prunus persica)和17个桃品种和品系为试验材料,通过PCR与RT-PCR克隆PpCBF2基因;并利用qRT-PCR分析‘早红霞’和‘大久保’叶片中PpCBF2在低温下的表达特性。结果表明:1)毛桃PpCBF2基因的DNA和cDNA全长序列均为894bp,开放阅读框为690bp,编码229个氨基酸并且含有CBF家族的AP2/EREBP功能域;2)供试的17个桃品种和品系的PpCBF2基因核苷酸序列全长和编码氨基酸数目与毛桃相同,但有9个品种发生1～2个氨基酸位点突变:其中‘白芒蟠桃’、‘81715’和‘大久保’的突变发生在N-豆蔻酰化位点或酪蛋白激酶II磷酸化位点;‘Italia 3’、‘寒露’和‘B6832’的突变发生在AP2/EREBP功能域;3)‘早红霞’和‘大久保’PpCBF2基因均被低温诱导,品种间表达水平有显著差异。综上,该基因在桃品种间进化较为保守,但少数品种基因功能位点发生了突变;该基因被低温显著诱导,与抗冷性有关。     

CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1基因在小尾寒羊下丘脑-垂体-卵巢轴的表达

为揭示类固醇生成相关基因CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1在绵羊多羔繁殖中的作用,以不同繁殖力小尾寒羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术检测CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1基因在小尾寒羊大脑、小脑、下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管中的表达。结果表明:CYP11A1基因主要在小尾寒羊卵巢、输卵管、子宫内表达;CYP11A1基因在单羔小尾寒羊卵巢的表达极显著低于多羔群体(P0.01),在子宫的表达量极显著高于多羔群体(P0.01);CYP17A1基因主要在小尾寒羊卵巢、输卵管、下丘脑表达;CYP17A1基因在多羔小尾寒羊群体下丘脑、子宫的表达量显著低于单羔群体(P0.05)。CYP19A1基因主要在小尾寒羊卵巢、下丘脑表达。本究结果提示CYP11A1、CYP17A1基因可能参与小尾寒羊多羔性状的调控。     

毛竹香豆酸-3-羟基化酶基因的克隆与表达研究

香豆酸-3-羟基化酶（C3H）是木质素单体合成中的一个关键酶。采用文库筛选的方法从毛竹萌发种子全长cDNA文库中克隆了1个C3H基因,命名为PheC3H.PheC3H基因全长1 842 bp,包括1个完整的开放阅读框,编码1个由513个氨基酸残基组成的蛋白（PheC3H）,C端具有1个细胞色素P450蛋白（CYP450）特异的保守结构域。相似性比对显示, PheC3H与其他植物的C3H有着较高的相似性,其中与小麦的CYP98A蛋白相似性最高,达91.2%;聚类分析表明,PheC3H属于CYP98A亚家族蛋白;实时定量PCR结果表明,PheC3H在一年生实生毛竹叶鞘中表达量最高,其次是在根中,在叶片和茎中表达量相对较低。     

葡萄VviSEP2基因的克隆及表达分析

【目的】克隆葡萄VviSEP2基因的完整开放阅读框(ORF)序列,明确其与胚珠败育型无核葡萄胚珠败育的关系。【方法】通过RT-PCR技术在‘无核白’葡萄中克隆葡萄VviSEP2基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析VviSEP2的表达模式。【结果】克隆得到一个无核葡萄胚珠发育相关基因,该基因cDNA序列长度为1 132bp,ORF为741bp,编码246个氨基酸。氨基酸多序列比对和进化树分析确认,该基因是E类MADS-box基因家族成员,命名为VviSEP2。表达分析结果表明,VviSEP2只在花蕾、花和胚珠中有表达,而在根、茎、叶中无表达,并且该基因在有核葡萄‘黑比诺’花与花蕾中的相对表达水平明显高于无核葡萄‘无核白’,同时VviSEP2基因在‘黑比诺’胚珠发育各时期的相对表达水平均高于‘无核白’,为后者的3~5倍。【结论】VviSEP2基因与无核葡萄的胚败育可能存在一定关系。     

苏州近郊4种不同森林群落稳定性研究

稳定性是一个评价群落结构与功能的指标,一直是生态学研究的热点。本文依据林分地上部分指标建立稳定体系,对苏州近郊4种人工林分,应用数学生态学方法,分析冬青针阔混交林、栎树针阔叶混交林、湿地松林和木荷林的林分稳定性。结果表明,多样性并不完全能够代表稳定性;4种林分群落稳定性主要因林分密度不同而异;稳定性依次为湿地松林＞冬青湿地松林＞栎树湿地松林＞木荷林。其中湿地松林可能会发展成为针阔混交林;木荷林中在生长过程中会因竞争产生限制,可能演替形成栎树—木荷混交林;2种针阔混交林在未来演替也可能向落叶阔叶、常绿阔叶混交林发展;该地区木荷林密度过大,稳定性较弱,应采取适当的抚育措施,提高其林分稳定性。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

干旱胁迫下不同品种小麦4种功能基因的表达模式及相关生理指标分析

采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)对干旱胁迫下脂质转移蛋白基因(TaLTP1)、膨胀素基因(TaEXPB23)、水通道蛋白基因(TaAQP7)和果聚糖6-果糖基转移酶基因(Ta6-SFT)在4种小麦叶片中的表达情况进行分析;通过测定相对水分质量分数和果聚糖质量分数来判断小麦生长发育状况。结果显示:干旱胁迫48h内,4种基因在不同抗旱性小麦叶片中的表达模式不同,干旱敏感型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,恢复到正常水平;干旱耐受型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,但仍维持较高表达水平;干旱耐受型小麦具有较高的相对水分质量分数和果聚糖累积量。以上结果表明,4种基因参与小麦干旱胁迫应答,4种基因的表达模式可以作为鉴定小麦抗旱的分子指标。本研究可为准确快速地鉴定小麦品种抗旱性提供重要分子依据。     

摘除眼柄与注射眼柄粗提物对凡纳滨对虾性腺发育相关基因表达的影响

利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。     

绣线菊内生真菌的分离及对植物病原菌的抑制作用

采用组织分离法,以PDA培养基为分离培养基,从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。平板对峙结果表明, 21株活性菌株对6种植物病原菌（辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌）有不同程度的抑制作用,其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73.2%、72.5%、39.5%和42.7%。通过测得的ITS rDNA 序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。生物学特性试验表明,该菌株在28～32℃时,选择PDA培养基,分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源,酸碱度中性的条件下,菌落的生长状况最佳。     

TmFAD2和BnFAD3双基因载体的构建及转化株脂肪酸分析

必需脂肪酸亚油酸(18∶2)和亚麻酸(18∶3)在植物中的合成过程一直备受研究者的关注。本研究利用旱金莲中合成亚油酸的油酸脱饱和酶基因TmFAD2及甘蓝型油菜中合成亚麻酸的亚油酸脱饱和酶基因BnFAD3,在pRD400骨架载体的基础上,构建同时表达TmFAD2和BnFAD3的串联双价载体pSFF。通过农杆菌介导的花序浸蘸法完成pSFF对拟南芥哥伦比亚野生型的转化,观察发现转基因植株的第1对真叶有不同程度的畸形。按照畸形程度将其划分为4个等级,气相色谱分析4个等级叶片及其后代种子中脂肪酸的组成及含量,发现随着畸形程度的增高,叶片和种子中亚麻酸C18∶3含量都呈现降低的趋势。     

小立碗藓PpLBD20基因敲除载体的构建及功能研究

LBD(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族.前期研究发现灰霉菌处理小立碗藓导致配子体中的PpLBD20上调表达,但PpLBD20的功能尚不明确.因此提取小立碗藓DNA,PCR扩增PpLBD20基因的上下游片段,依次插入PTN182载体,利用同源重组原理构建敲除表达载体,酶切和测序验证插入序列的正确性.通过工作浓度为20％的PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选鉴定得到敲除PpLBD20后的突变体植株,观察到敲除后小立碗藓不形成茎叶体结构且配子体成丝状.结果为深入探究PpLBD20在小立碗藓的形态建成调控病原菌侵染的抗性作用奠定基础.     

结球甘蓝类钙调蛋白基因 CML48和 CML50在不同胁迫下的表达分析

为探究结球甘蓝类钙调蛋白（CMLs）响应不同胁迫时的功能,丰富CMLs参与钙信号网络调控,为CMLs参与植物逆境途径及其功能的研究提供依据。以结球甘蓝ZG为材料,克隆得到 CML48和 CML50基因,序列分析表明 CML48开放阅读框（ORF）为672 bp,含4个内含子,编码223 aa,分子量为25.28 ku; CML50开放阅读框ORF为1 095 bp,编码364 aa,分子量为38.06 ku,含3个内含子;均为亲水蛋白,均含有2个EF-hand结构域;系统发育树表明 CML48和 CML50均与甘蓝处于同一进化枝,与白菜、油菜的亲缘关系最近。qPCR表明 CML48和 CML50在干旱(PEG6000)、盐胁迫(NaCl)、低温(4 ℃)、高温(37 ℃)、H₂O₂、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）等不同胁迫处理下,在叶和根中的表达均有上调,且 CML50的表达量均显著高于 CML48, CML48在茎尖中高度响应高温胁迫,而在根中不响应高温和H₂O₂胁迫。初步说明 CML48和 CML50在根和叶中均可响应上述8种非生物胁迫。     

新疆野生樱桃李PsoRPM2与PsoLFY互作调控植株开花的分子机制

为明确新疆野生樱桃李PsoRPM2基因引起植株的早开花现象，本研究通过形态学、转基因以及酵母双杂等试验对PsoRPM2基因进行了分析。结果显示:新疆野生樱桃李极早花、早花、中花、晚花和极晚花的比率分别为11%、24%、44%、18%和3%。早花类型的花芽分化明显快于晚花类型，早花花芽中的PsoLFY和PsoFT基因表达高于晚花，而PsoFLC基因则在晚花中表达较高。转PsoRPM2基因烟草表现为早花，并且NtLFY基因表达明显升高。在新疆野生樱桃李早花花芽中，PsoRPM2基因表达高于晚花，同一时期的PsoLFY基因表达也较高。酵母双杂试验显示，PsoRPM2与PsoLFY可以互作。综上，新疆野生樱桃李之所以早花是通过PsoRPM2与PsoLFY互作，提高花芽中PsoLFY和PsoFT基因表达，从而加快花芽分化进程，导致植株提前开花。