小尾寒羊GnRH基因组织表达、多态性及其与产羔性状关联分析

为揭示GnRH基因在小尾寒羊下丘脑-垂体-卵巢轴(Hypothalamic-pituitary-ovarian axis,HPOA)中的表达规律、多态性及其与产羔数的关系,深入了解其对小尾寒羊多羔的作用,采用实时荧光定量PCR技术对6只小尾寒羊(FecB++型单、多羔母羊各3只)的生殖组织及脑组织中GnRH基因的表达谱进行分析,同时采用Sequenom MassARRAY~?SNP技术对380只小尾寒羊和共380只的小尾寒羊、滩羊、苏尼特羊、策勒黑羊、湖羊和草原型藏羊GnRH基因2个单核苷酸多态性位点(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)的进行多态性检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果显示,GnRH基因在下丘脑、卵巢和子宫组织均有表达,其中在下丘脑高表达。在小尾寒羊多羔群体中,GnRH基因在卵巢、大脑、下丘脑、垂体的表达均极显著高于单羔群体(P0.01),暗示其可能参与了小尾寒羊多羔性状调控。分型发现GnRH基因2个位点基因型频率和等位基因频率在单、多羔品种间差异均不显著(P0.05)。关联分析表明,GnRH基因的2个SNPs位点的多态性与小尾寒羊各胎产羔数差异均不显著(P0.05);2个SNPs在所有绵羊品种中均表现为低度多态(PIC0.25);卡方适合性检验表明,2个SNPs在各个绵羊品种中均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05)。     

黄体期和卵泡期小尾寒羊KiSS-1与RFRP-3组织表达研究

为分析KiSS-1和RFRP-3基因在小尾寒羊不同繁殖时期(黄体期和卵泡期)下丘脑、垂体、性腺轴各组织中的表达差异,阐明这2个基因在绵羊发情转换中的表达模式,以常年发情的小尾寒羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术,对比分析了KiSS-1和RFRP-3基因在黄体期和卵泡期的小尾寒羊下丘脑—垂体—性腺轴各组织中的表达差异。结果表明:1)KiSS-1和RFRP-3基因在下丘脑、垂体、卵巢等10种组织中均有表达;2)黄体期和卵泡期下丘脑中KiSS-1基因表达量均显著高于其他组织(P0.05),卵泡期下丘脑和松果体中KiSS-1基因表达量均显著高于黄体期(P0.05);3)黄体期和卵泡期下丘脑和卵巢中RFRP-3基因的表达量均显著高于其他组织(P0.05),且卵巢中RFRP-3基因在黄体期的表达量显著高于卵泡期(P0.05)。综上,研究发现KiSS-1和RFRP-3基因在绵羊发情调控中均发挥重要作用,KiSS-1促进发情而RFRP-3抑制发情。     

绵羊繁殖轴相关组织TPH1和TPH2基因表达分析及TPH2基因多态性与产羔数的关系

为探讨TPH1和TPH2基因在绵羊不同繁殖状态下的表达差异及TPH2基因多态性与小尾寒羊产羔数的关系,利用实时荧光定量PCR技术检测该2个基因在不同繁殖状态下成年苏尼特羊(短光照3只,长光照3只)和小尾寒羊(卵泡期3只,黄体期3只)的大脑、小脑、下丘脑、松果体、垂体、卵巢、输卵管、子宫、肾脏和肾上腺等10种组织中的相对表达量;同时采用Sequenom MassARRAY?SNP技术检测TPH2基因单核苷酸多态位点SNP在常年发情绵羊品种(小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊)和季节性发情绵羊品种(滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊)的多态性,并将基因多态性与小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果表明:该2个基因在2个绵羊品种各组织广泛表达,TPH1基因在苏尼特羊下丘脑和松果体中短光照表达量极显著高于长光照(P0.01),在苏尼特羊垂体中短光照表达量显著高于长光照(P0.05),在小尾寒羊垂体和卵巢中卵泡期显著低于黄体期(P0.05);TPH2基因在苏尼特羊卵巢组织长光照下的表达量显著高于短光照(P0.05),TPH2基因在小尾寒羊下丘脑组织中卵泡期的表达量极显著高于黄体期(P0.01)。小尾寒羊中TPH2基因g.107854166CT和g.1078541669CT 2个SNP位点关联分析表明,该2个位点与季节性发情性状和小尾寒羊第1、2以及第3胎产羔数均无显著关联(P0.05)。综上,TPH1和TPH2基因在苏尼特羊绵羊下丘脑和松果体中呈季节性光照节律差异表达,暗示其可能参与季节性发情上游基因的调控,而TPH2基因可能参与调控小尾寒羊下丘脑中激素分泌和卵巢发育,但g.107854166CT和g.1078541669CT不是调控季节性发情和小尾寒羊产羔数的关键位点。     

PPP3CA·PLCB1和STK3基因在小尾寒羊性腺轴组织中的表达量研究

为揭示候选基因PPP3CA、PLCB1和STK3在绵羊多羔中的作用，以不同产羔数小尾寒羊为研究对象，采用实时荧光定量PCR技术检测PPP3CA、PLCB1、STK3基因在小尾寒羊大脑、小脑、下丘脑、垂体、卵巢、子宫和输卵管中的表达情况。结果表明：PPP3CA基因在小尾寒羊卵巢内的相对表达量高于其他组织，其在FecB BB型小尾寒羊下丘脑中的相对表达量显著高于++型(P<0.05),其在FecB BB型小尾寒羊输卵管中的相对表达量极显著高于++型(P<0.01);PLCB1基因在FecB BB型小尾寒羊小脑中的相对表达量最高，FecB BB型小尾寒羊垂体和卵巢组织中的相对表达量显著高于++型(P<0.05);STK3基因在++型小尾寒羊大脑中的相对表达量高于其他组织，其在FecB BB型小尾寒羊卵巢中的相对表达量极显著高于++型(P<0.01)。该研究结果表明PPP3CA、PLCB1、STK3基因可作为潜在候选基因，参与小尾寒羊多羔性状的调控，且具有一定的正向调节作用。     

MITF基因表达与绵羊季节性发情及产羔数关系初探

为初步探究MITF基因表达和绵羊季节性发情及产羔数的关系,本试验以季节性发情的苏尼特羊(Sunite sheep,SNT)和常年发情的小尾寒羊(Small Tail Han sheep,STH)为研究对象,利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析SNT在不同光照条件下(短光照、长光照)及STH不同繁殖时期(卵泡期、黄体期)的下丘脑等组织中MITF基因的表达差异及该基因在STH单、多羔母羊卵泡期繁殖器官(卵巢、子宫体、输卵管)中的表达差异。结果表明:1)MITF基因在2个绵羊品种的不同组织中广泛表达且繁殖器官(卵巢、子宫体和输卵管)中该基因表达量较高;2)在长光照条件下SNT垂体中MITF表达量极显著高于短光照条件下表达量(P0.01);3)STH卵巢中MITF表达量在卵泡期极显著高于黄体期(P0.01),而子宫体、输卵管中该基因表达量在黄体期显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于卵泡期;4)单羔组STH子宫体、输卵管中MITF表达水平极显著(P0.01)或显著(P0.05)高于多羔组。综上,MITF基因表达与绵羊季节性发情及产羔数存在一定关联,需要进一步进行生物学功能验证。     

TGF-β通路相关基因在绵羊性腺轴组织的表达分析

为探究候选基因INHBB、SMAD4和FGF18对发情性状及BMP6、TGFBR2和SKP1对产羔数的影响机制,利用荧光定量PCR分别检测INHBB、SMAD4和FGF18在FecB++型卵泡期和黄体期小尾寒羊,以及BMP6、TGFBR2和SKP1在FecB++和FecBBB型卵泡期小尾寒羊下丘脑、垂体、卵巢、输卵管和子宫中表达差异.INHBB在小尾寒羊5个组织中均表达,垂体和卵巢中表达量最高,卵泡期卵巢和子宫中INHBB表达量极显著高于黄体期(P＜0.01),黄体期输卵管中表达量极显著高于卵泡期榆卵管(P＜0.01);SMAD4在小尾寒羊5个组织中均表达,在垂体中表达量最高,黄体期子宫中SMAD4表达量极显著高于卵泡期子宫(P＜0.01);在小尾寒羊5个组织中,FGF18在输卵管中表达量最高,垂体中表达量低,卵泡期输卵管中该基因表达量极显著高于黄体期(P＜0.01);BMP6在小尾寒羊5个组织中均表达,垂体中表达量最高,FecBBB型下丘脑中BMP6表达量极显著高于FecB++(P＜0.01);TGFBR2在小尾寒羊5个组织中均表达,卵巢中表达量最高,FecB++型子宫中TGFBR2表达量极显著高于FecBBB型(P＜0.01);SKP1在小尾寒羊5个组织中均表达,下丘脑和垂体中表达量最高,FecBBB型垂体中SKP1表达量极显著高于FecB++(P＜O.01).研究显示这6个基因可能对绵羊繁殖力有一定影响.     

斑马鱼CYP11a1基因在不同性腺发育时期的表达

采用实时荧光定量PCR技术,分析了斑马鱼Danio rerio的CYP11a1基因在成鱼4个组织和性腺发育3个时期的表达情况。结果表明:CYP11a1基因在卵巢、精巢、肌肉和脑组织中均有表达且存在差异,在脑中表达量最低(P0.05),在卵巢、精巢、肌肉中的表达量分别为脑中表达量的204.7倍、38.9倍、17.0倍;CYP11a1基因在3个卵巢发育时期的表达量表现为先降低后升高的趋势,其在卵巢成熟期的表达量最低(P0.05),在卵巢成熟前期、卵巢成熟后期的表达量分别为卵巢成熟期表达量的1.7倍、1.5倍;CYP11a1基因在3个精巢发育时期的表达量表现为先升高后降低的趋势,在精巢成熟期表达量最高(P0.05),分别为精巢成熟前期、精巢成熟后期表达量的6.5倍、13.4倍。研究表明,尽管CYP11a1基因在卵巢和精巢发育过程中的表达规律不同,但CYP11a1基因在一定程度上与斑马鱼的性腺发育相关,其可能在促进斑马鱼精子成熟中发挥一定作用。     

绵羊BMPR1A基因组织表达及其多态性与产羔数的关联分析

为探索BMPR1A基因在不同生理时期(卵泡期和黄体期)和不同繁殖力(单羔组和多羔组)小尾寒羊组织表达特征及其多样性与小尾寒羊产羔数的关系,采用qPCR技术检测BMPR1A基因在小尾寒羊14种组织中的表达特征。同时,采用Sequenom MassARRAY~?SNP技术对BMPR1A基因3个SNPs位点在大群中的多态性进行检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联。qPCR结果显示,BMPR1A在14种组织中均有表达,其中在大脑、下丘脑和甲状腺组织高表达;BMPR1A在卵泡期和黄体期多羔组下丘脑和卵巢组织表达量均高于单羔组,但未达到显著水平。分型发现BMPR1A基因g.41128335AT和g.41127600CT位点在单、多羔绵羊品种间的基因频率和基因型频率达到显著水平。卡方适合性检验结果显示,3个SNPs在大多数绵羊品种中均处于Hardy-Weinberg平衡状态。关联分析结果发现,3个SNPs多态性与小尾寒羊各胎产羔数均无显著相关,但g.41128335AT和g.41127598AG位点突变型产羔数基本上均高于野生型。以上结果初步表明,BMPR1A基因表达与小尾寒羊产羔数增加存在一定程度的正相关,但3个SNPs与小尾寒羊各胎产羔数均无显著关联,说明它们可能均不是影响BMPR1A基因功能的关键位点。     

发情相关基因在小尾寒羊性腺轴组织中的表达谱研究

[目的]探究绵羊发情相关基因KITLG、MAPK1、NOTCH4和NR5A2在小尾寒羊性腺轴组织(大脑、小脑、下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管)中的表达差异,为阐明绵羊高繁殖力的分子机理提供理论依据。[方法]以FecB BB型小尾寒羊为研究对象,利用实时荧光定量PCR检测上述4个基因在小尾寒羊发情周期(黄体期和卵泡期)性腺轴相关的7种组织中的表达差异。[结果]KITLG基因在小尾寒羊卵泡期输卵管组织中的表达量最高,其在黄体期小脑与垂体中的表达量显著高于卵泡期(P<0.05);MAPK1基因在小尾寒羊卵泡期大脑组织中的表达量最高且极显著高于黄体期(P<0.01),其在黄体期下丘脑和小脑组织中的表达量显著高于卵泡期(P<0.05),而其在卵泡期输卵管组织中的表达量显著高于黄体期(P<0.05);NOTCH4基因在小尾寒羊黄体期下丘脑中的表达量最高,而其在黄体期子宫中的表达量显著高于卵泡期(P<0.05);NR5A2基因在小尾寒羊黄体期卵巢组织中的表达量最高,其在黄体期子宫组织中的表达量显著高于卵泡期(P<0.05)。[结论]KITLG、MAPK1、NOT...     

绵羊Izumo1基因多态性及其与产羔数关联分析

为研究Izumo1基因多态性及与产羔数关系,本研究利用PCR和直接测序法对小尾寒羊和苏尼特羊的Izumo1基因DNA序列进行扩增、测序和BLAST分析,并和本课题组前期绵羊重测序数据进行比对,筛选出Izumo1基因SNP位点。同时,采用Sequenom MassARRAY~?技术进行基因分型,并对其SNP位点的基因型和等位基因频率在各群体中的分布进行研究。结果表明:小尾寒羊Izumo1基因DNA全长序列3 385 bp,苏尼特羊Izumo1基因DNA全长序列3 382 bp;筛选出8个Izumo1基因SNP位点,经过初步筛选,将在小尾寒羊、苏尼特羊、滩羊、萨福克羊、杜泊羊、草原藏羊这6个绵羊品种中位点分布没有差异的SNP位点排除,最终筛选获得的g.54412135AG和g.54412107CA 2个位点。Izumo1基因g.54412135AG位点在多羔和单羔绵羊品种中存在GG、GA和AA 3种基因型,G基因为优势等位基因;g.54412107CA在多羔品种中存在CC和CA 2种基因型,而在单羔品种中存在CC、CA和AA 3种基因型,C基因为优势等位基因,其基因型频率和基因频率在单、多羔绵羊群体间的分布差异均极显著(P0.01);群体遗传学分析得出g.54412135AG多态位点在6个品种中的多态信息含量(PIC)都属于低度多态(PIC0.25);g.54412107CA多态位点在杜泊羊中属于中度多态(0.25PIC0.5),在其他5个品种中都属于低度多态(PIC0.25),然而,关联分析发现Izumo1基因g.54412135AG和g.54412107CA位点的不同基因型与小尾寒羊不同胎次产羔数之间不存在显著关联(P0.05)。     

绵羊SMAD1基因组织表达及其多态性与产羔数关联分析

【目的】绵羊产羔数是一个极其复杂的性状,受诸多因素影响。绵羊排卵数是最重要的因素之一,而SMAD蛋白在哺乳动物卵泡发育和颗粒细胞生长分化过程中发挥着重要作用。因此本文基于前期绵羊基因组重测序数据,深入研究SMAD家族成员1 (SMAD family member 1, SMAD1)基因在不同繁殖力小尾寒羊组织表达模式,并探讨其多态性与绵羊产羔数的关系,以揭示其影响产羔数的机制,为绵羊分子育种提供科学依据。【方法】首先,采用反转录PCR技术检测SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊群体大脑,小脑,下丘脑,垂体,子宫,卵巢,输卵管,心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,肾上腺,甲状腺,大肠,小肠,胰腺,瘤胃,肾脂 19种组织的表达模式,然后利用实时荧光定量PCR技术检测SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊下丘脑,垂体,子宫,卵巢,输卵管5种繁殖组织的相对表达量。随后采用Sequenom MassARRAY ^?SNP技术对SMAD1基因5个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点在小尾寒羊（n=380）、湖羊（n=101）、苏尼特羊（n=21）、草原型藏羊（n=161）、策勒黑羊（n=52）、滩羊（n=22）6个绵羊品种中进行基因型检测,计算其群体遗传学指标,利用SPSS19.0软件分析5个SNPs与小尾寒羊产羔数的相关性。【结果】PCR结果显示,SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊全身性组织均有表达,在小尾寒羊单羔群体卵巢的表达量极显著高于多羔群体（P<0.01）,小尾寒羊单羔群体下丘脑、垂体的表达量显著高于多羔群体（P<0.05）;基因分型结果表明,g.12485895A>G,g.12487558G>A和g.12487190G>T位点在单、多羔绵羊品种中基因型和等位基因频率均差异显著（P<0.05）;而g.12508874T>C和g.12487467A>G位点在单、多羔绵羊品种中基因型和等位基因频率均差异不显著（P>0.05）;群体遗传学分析表明,g.12485895A>G、g.12487558G>A、g.12508874T>C、g.12487467A>G、g.12487190G>T位点在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、苏尼特羊、草原型藏羊中均为中度多态（0.25<PIC<0.5）,g.12508874T>C位点在滩羊群体表现为低度多态（PIC<0.25）;卡方适合性检验表明,g.12485895A>G和g.12487467A>G位点在小尾寒羊和草原型藏羊中处在Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05）,g.12487558G>A在小尾寒羊和湖羊群体处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05）,g.12487190G>T位点在草原型藏羊处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05）。其他位点在6个绵羊品种中均处在Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）;关联分析表明,g.12485895A>G,g.12487558G>A,g.12508874T>C和g.12487467A>G位点与小尾寒羊产羔数无显著关联。g.12487190G>T位点TT基因型母羊前三胎的产羔数均显著高于GT和GG基因型母羊（P<0.05）。将该位点与小尾寒羊FecB（A746G）不同基因型进行组合后发现,AA-GG、AA-GT、AA-TT型母羊产羔数显著低于其他组合基因型母羊（P<0.05）。【结论】SMAD1与小尾寒羊繁殖密切相关,g.12487190G>T可作为小尾寒羊产羔性状选育的潜在分子标记。     

Study on FSHR and LHR mRNA Levels of Different BMPRIB Genotypes of Small Tail Han Sheep During the Oestrum

The relationship between different BMPRIB genotypes of Small Tail Han sheep and FSHR and LHR mRNA levels during the oestrum was studied using semiquantitative PCR. The results indicated that FSHR mRNA extracted from the right ovary of BB (1.14 ± 0.11) ewes showed higher levels compared with AA (0.44 ± 0.11) and AB (0.36±0.08) ewes (P ＜ 0.01), and LHR mRNA extracted from the right ovary of BB (0.42±0.02) ewes showed significantly higher levels compared with AA (0.23 ±0.02) and AB (0.25 ±0.04) ewes (P＜0.01); however, the mRNA extracted from the left ovary showed no significant difference in levels among the genotypes during the oestrum. It indicated that the fecundity induced by a mutation of BMPRIB in Small Tail Han sheep may be related to the changes of the mRNA expression of LHR and FSHR in ovary.     

NELL1和FMO3基因mRNA在绵羊肝脏与脂肪组织中的表达

旨在探究不同营养水平及不同生长阶段脂尾型绵羊NELL1和FMO3基因mRNA的组织特异性表达模式。选择健康、体质量相近的9月龄滩羊、同羊、哈萨克羊和西藏羊(羯羊)各3只,活体采集尾部脂肪样品。选择健康4月龄滩羊112只随机分为4组,公母各半,每组4个重复,每个重复7只羊。根据体质量增加目标分为3个阶段:22~28kg,28~35kg,35~40kg,每个阶段各组分别饲喂不同营养水平的日粮。每个生长阶段结束时采集肝脏、肾周脂肪、尾脂、皮下脂肪的组织样品,提取样品总RNA,采用实时荧光定量PCR的方法分析NELL1和FMO3 mRNA的表达差异。结果表明,FMO3 mRNA在哈萨克羊尾脂中的表达量最高,在同羊、滩羊、西藏羊尾脂中依次下降,且差异显著;NELL1 mRNA在西藏羊尾脂中的表达量最高,在滩羊、同羊、哈萨克羊中的表达量依次下降;营养水平和月龄对尾脂和肝脏中NELL1和FMO3 mRNA的表达水平有显著影响,而对皮下脂肪和肾周脂肪中NELL1和FMO3 mRNA的表达影响不显著。表明FMO3mRNA的表达水平与脂肪沉积呈正相关,而NELL1 mRNA的表达水平与脂肪沉积呈负相关;NELL1与FMO3对绵羊尾脂和肝脏中的脂肪沉积起调控作用,为进一步揭示脂尾型绵羊体内脂肪沉积的调控机制提供理论基础。     

牦牛bta-miR-1434-5p和Smad1基因组织表达谱及荧光素酶报告载体构建

为探索牦牛Smad1基因与bta-miR-1434-5p是否存在靶向关系,探究bta-miR-1434-5p分子调控可能机制,利用RT-PCR技术对bta-miR-1434-5p和Smad1 mRNA在牦牛组织中的表达谱进行检测,并构建pmiR-RBREPORTTM双荧光素酶报告载体对牦牛Smad1基因3′端非翻译区(3′UTR)与bta-miR-1434-5p的靶向关系进行研究。结果表明:Smad1基因mRNA在牦牛下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、淋巴结、卵巢、输卵管、子宫组织中均有广泛表达;bta-miR-1434-5p除在牦牛输卵管中没有表达外,在其他组织均与Smad1基因mRNA共表达;获得牦牛Smad1基因3′UTR序列并成功构建野生型及突变型pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告质粒;荧光素酶活性检测发现bta-miR-1434-5p mimics对Smad1野生型质粒报告荧光没有明显的下调作用,由此推测btamiR-1434-5p与牦牛Smad1基因的该段3′UTR之间未发现明显互作。     

棉铃虫细胞色素P450家族 CYP6AE14 基因克隆、序列分析及蛋白原核表达

采用同源克隆技术克隆石河子棉区棉铃虫抗性品系的P450家族解棉酚基因 CYP6AE14 。克隆获得的目的基因全长1 581 bp,编码526个氨基酸。序列分析表明,该抗性品系的 CYP6AE14 有1个氨基酸发生突变,即Y25F;其与烟草天蛾的CYP6AE32同源性较高,达60%。利用原核表达载体pET28 a在大肠杆菌中成功表达棉铃虫P450 CYP6AE14 基因,为进一步的基因功能验证奠定基础。