热带兰花2种病毒的ELISA检测

采用三抗夹心酶联免疫吸附法（TAS-ELISA）和双抗夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）检测了海南主要兰花种植基地的疑似病毒感染的兰花叶片。结果表明,海南兰花病原病毒主要为建兰花叶病毒（Cym-bidium mosaic virus,CymMV）、齿兰环斑病毒（Odontoglossum ring-spot vi...     

广东兰花两种主要病毒的检测

采用双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)对44个兰花病样分别检测建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV )和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV),结果显示,有59.1%的兰花检出CyMV,36.4%的兰花检出ORSV,22.7%的兰花复合感染了CyMV和ORSV.采用一步逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对24个兰花病样进行检测,结果有83.3%的兰花检出 CyMV,75%的兰花检出ORSV,66.7%的兰花复合感染了CyMV和ORSV,可见RT-PCR检测灵敏度高于ELISA.     

兰花两种主要病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据建兰花叶病毒(Cymbidiummosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspot virus,ORSV)这两种主要兰花病毒的保守序列设计特异性引物,在CymMV和ORSV单一RT-PCR优化体系的基础上,建立了同时检测CymMV和ORSV的双重RT-PCR检测方法。此方法可特异性地从感染CymMV和ORSV的样品中扩增出2条目的带,即CymMV(781 bp)和ORSV(588 bp)。扩增产物测序表明,CymMV扩增产物与GenBank中登陆的分离物核苷酸同源性为84%~97%,ORSV扩增产物与GenBank中其它分离物的核苷酸序列同源性为98%~99%。运用该方法对随机抽取的田间样品及组培苗样品进行检测,都得到了特异性扩增条带,其灵敏度达到了10-5。     

一步法 RT-LAMP-HNB 检测兰花建兰花叶病毒和齿舌兰环斑病毒方法的建立

【目的】全世界兰花病毒有 50 余种，建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）和齿舌兰 环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV）是其中最常见的两种病毒。目前仍没有有效的措施能够控制病毒 病，因此建立针对病毒的高效监测、检测方法，对控制兰花病毒感染具有至关重要的意义。【方法】以兰花病 毒 CymMV 和 ORSV 为试验材料，采用反转录 - 环介导等温扩增方法（RT-LAMP）进行病毒 RNA 的扩增，从而 建立 CymMV 和 ORSV 的快速检测方法。分别根据两种病毒的 cp 基因序列保守区设计 RT-LAMP 引物，在一步 法 RT-LAMP 反应体系中加入羟基萘酚蓝（HNB，终浓度 200 µmol/L）作为扩增产物指示剂，不需开盖进行凝胶 电泳检测，便可直接根据体系颜色变化判读反应结果。【结果】利用该检测方法能够在 2 h 测出样品中是否存在 CymMV 和 ORSV 病毒 RNA，其灵敏度是 RT-PCR 的 10 倍。对 20 株田间样品进行一步法 RT-LAMP-HNB 检测， 根据田间检测结果显示，CymMV 检出率为 70%，ORSV 检出率为 55%，与 RT-PCR 结果保持一致，该法适用于 田间样品检测。【结论】建立的一步法 RT-LAMP-HNB 是一种灵敏、快速、特异、便捷的 CymMV 和 ORSV 检 测方法，仅需要简单控温设备如水浴锅便可进行核酸扩增，适用于在基层或不便利地区推广使用。     

RT-PCR检测齿兰环斑病毒技术的建立

根据已报道的齿兰环斑病毒(ORSV)外壳蛋白(CP)基因序列,进行同源性比较,设计了一对各为20bp的引物.通过优化试验条件,建立了稳定的RT-PCR检测ORSV体系,其检测灵敏度可达0.01ng·mL-1.将此方法与ELISA进行比较,结果表明,RT-PCR检测灵敏度比ELISA高1000倍.应用这两种方法同时检测了138瓶兰花组培苗样品,其中RT-PCR检测出32瓶兰花组培苗感染病毒,而ELISA只能检测其中的18瓶.     

一步式IC-RT-PCR同时检测2种兰花病毒的探讨

齿兰环斑病毒(Odontoglossum ring-spot virus,ORSV)和建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)复合侵染兰科植物的现象在自然界中非常普遍。通过设计一对简并引物可以同时扩增获得复合感染的兰科植物中两种病毒核酸片段(CymMV约558 bp,ORSV约825 bp),由此建立一步式免疫捕获-反转录-聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)技术以检测2种病毒的复合侵染情况。利用该技术对来自广东汕头的35株兰样进行感病性测试,发现31株呈阳性,感病率为88%。阳性株中,ORSV感染率为87%(27株),CymMV感染率为29%(9株),复合感染率16%(5株),说明这一地区ORSV感病率较高,并与CymMV存在明显复合感染。扩增条带T载体克隆测序表明,与已知CymMV和ORSV分离物的核酸分子平均同源性分别高达97%和99%。     

齿兰环斑病毒RT-qPCR检测方法的建立

【目的】针对齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, ORSV)建立快速、有效检测方法,对于保障兰花规模化生产有重要意义。【方法】以齿兰环斑病毒为材料,根据NCBI上已登录的齿兰环斑病毒外壳蛋白(coat protein, cp)基因序列分析其序列保守区,使用Primer Premier 5.0设计反转录荧光定量PCR引物及TaqMan荧光探针,建立检测齿兰环斑病毒的一步法RT-qPCR。构建齿兰环斑病毒cp基因克隆质粒,并以该质粒作为标准品进行荧光定量PCR标准曲线测定;以齿兰环斑病毒、建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)的病毒RNA为模板进行一步法RT-qPCR特异性检测;以10倍倍比稀释的cp基因质粒为模板进行灵敏性检测;用该法对大田18个兰花样品进行齿兰环斑病毒感染情况监测。【结果】齿兰环斑病毒一步法RT-qPCR检测法仅检出齿兰环斑病毒阳性模板,其余模板检测结果为阴性,说明检测方法具有特异性;该方法能够检测到的齿兰环斑病毒cp基因最低拷贝数...     

进境美国大豆幼苗中菜豆荚斑驳病毒的检测与鉴定

从进口美国大豆中挑选具有典型斑驳症状的种子,在隔离温室内种植.出苗后,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)进行菜豆荚斑驳病毒(bean pod mottle virus,BPMV)的血清学检测.对BPMV血清学反应阳性的幼苗进一步采用反转录(RT)PCR方法和测序方法进行鉴定.结果从大豆幼苗中筛选并鉴定出菜豆荚斑驳病毒.     

进境美国大豆幼苗中菜豆荚斑驳病毒的检测与鉴定

从进口美国大豆中挑选具有典型斑驳症状的种子,在隔离温室内种植.出苗后,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)进行菜豆荚斑驳病毒(bean pod mottle virus,BPMV)的血清学检测.对BPMV血清学反应阳性的幼苗进一步采用反转录(RT)PCR方法和测序方法进行鉴定.结果从大豆幼苗中筛选并鉴定出菜豆荚斑驳病毒.