进境美国苜蓿草中苜蓿黄萎病菌的检疫鉴定

从一批进境的美国苜蓿草样品中分离得到了一株与苜蓿黄萎病菌(Verticillium albo-atrum)相似的分离物M1。该分离物原始菌落为白色,边缘规则呈圆形,菌丝较致密,气生菌丝较少,苜蓿组织块不被菌丝覆盖,菌落生长速度为小于2.5 mm/d;M1在PDA上进行纯培养,前6d内,菌落为白色圆形,容易产生分子孢子轮枝状分生孢子梗,7d后菌落中央表面因产生休眠菌丝开始变成黑褐色至黑色,20d后菌落的表面和背面大部分均变黑色,仍不产生微菌核和厚垣孢子。M1的DNA用V.albo-atrum特异引物Vaa1/Vaa2进行检测,PCR扩增后得到预期330 bp的产物片段,产物序列与V.albo-atrum相应序列的相似性为100%。该分离物接种苜蓿草根部,15d后引起苜蓿黄萎病的典型症状。根据分离物的形态特征、PCR检测结果、PCR产物序列分析,以及致病性测定结果,将进境美国苜蓿草样品中的分离物M1鉴定为苜蓿黄萎病菌。     

玉米细菌性枯萎病菌的环介导恒温扩增(LAMP)检测方法

为了提高口岸和基层实验室检疫和监测玉米细菌性枯萎病菌的准确性和工作效率,利用环介导恒温扩增技术(LAMP),根据内切葡聚糖酶(EGase)基因前导序列,设计2个内引物和2个外引物,对玉米细菌性枯萎病菌进行快速检测。结果表明,使用玉米细菌性枯萎病菌的近缘种或引致相似症状的病原菌菊欧文氏菌玉米致病变种Erwinia chrysanthemi pv.zeae、玉米内州萎蔫病菌Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis、燕麦假单胞菌Pseudomonas avenae、杓兰欧文氏菌Erwinia cypripedii检测其特异性,仅玉米细菌性枯萎病菌有扩增。LAMP检测灵敏度达到2 pg DNA,为普通PCR的100倍;与其它检测方法相比,LAMP方法检测时间短,效率高,不仅降低了设备投入,易于操作,而且具有较高的灵敏度和特异性,适合玉米细菌性枯萎病菌的现场检疫和大规模检测。     

进境荷兰郁金香种苗中南芥菜花叶病毒的鉴定

为了防止南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)传入我国,采用血清学、分子生物学、电镜观察及生物学接种等方法对从荷兰进口的郁金香种苗进行了ArMV检测。结果表明:ArMV血清学反应为强阳性;RT-PCR反应扩增出370bp的特异性目标条带;RT-PCR产物与已报道的3个ArMV部分外壳蛋白基因的核苷酸序列同源性为91.00%～93.24%,氨基酸序列同源性为99%～100%;免疫电镜观察到叶片病汁液中含有直径约30nm的球状病毒粒体;该病毒在黄花烟、白肋烟、矮牵牛和昆诺藜等鉴别寄主上引起坏死和褪绿等典型症状,经DAS-ELISA检测,这些接种寄主均呈ArMV血清学阳性反应。故将该病毒鉴定为南芥菜花叶病毒。     

遵循国际标准制定我国有害生物检疫鉴定标准的必要性

国际贸易中因有害生物诊断异议的贸易纠纷不断发生,国际植物检疫措施标准委员会出台的<限定性有害生物诊断准则>(ISPMs.27)规定了有害生物诊断标准的模板和内容,提出对限定性有害生物的诊断在技术要素部分需包括有害生物背景、有害生物分类地位、有害生物检测、有害生物鉴定、相关记录、相关资料的联系方式、致谢、参考资料等8个方面的内容,本文提出我国有害生物诊断标准采用国际标准的必要性.     

江苏局从进口美国大豆中截获烟草环斑病毒

2005年初,江苏局继从进口美国大豆中检出菜豆荚斑驳病毒后,又首次从进境的3.86万t美国大豆中检出我国禁止进境的二类危险性有害生物--烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,简称TRSV)该危险性病毒的寄主范围十分广泛.带毒种子是该病毒进行远距离传播扩散的主要途径.     

小麦印度腥黑穗病菌的截获及各国检疫措施

本文就从美国面粉中截获小麦印度腥黑穗病菌的过程作了介绍，并综述了该病原菌与植物检疫的有关情况以及世界各国针对该病原菌采取的检疫措施。     

基于环介导等温扩增技术检测大豆北方茎溃疡病菌

[目的]传统的以ITS(内转录间隔区)为靶序列对大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.caulivora,DPC)的分子检测无法区分大豆南方茎溃疡病菌(D.phaseolorum var.meridionalis)和大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla)等近似种。笔者在大豆北方茎溃疡病菌靶标序列筛选中,发现了翻译延伸因子(translation elongation factor 1α,tef1α)序列。通过目标病原菌与其相似种比对发现,大豆北方茎溃疡病菌在tef1α序列上有很好的特异性,适合作为分子检测的靶标。[方法]基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以tef1α为靶序列,设计LAMP特异性引物,建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的DPC检测方法,并进行特异性、灵敏度、植株接种试验和进口大豆夹带大豆病残体检测。[结果]该方法仅需60 min,即可通过肉眼直接目测试验结果。64℃等温条件下进行核酸扩增反应60 min,反应结束后,加入SYBR greenⅠ染料,根据染料颜色变化判定扩增结果。特异性试验中,在DPC菌株中扩增到梯形条带,同时加入SYBR greenⅠ染料后可观察到绿色荧光的阳性反应;而在其他供试菌株中均没有出现梯形条带,加入SYBR greenⅠ染料后则保持橙色的阴性反应。该技术最低检测限为1 pg·μL-1目标菌纯DNA。tef1α-LAMP技术能够检测出所有人工接种发病豆苗中的目标菌。在口岸截获的大豆病残体检测中,tef1α-LAMP技术能够在10 g进口大豆中夹带的大豆植株残体中最低检测出10个子囊孢子。[结论]该方法的建立为大豆北方茎溃疡病菌的检疫以及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。     

玉米幼苗期耐盐性评价适宜盐浓度的研究

为探明玉米幼苗期耐盐性评价的适宜NaCl浓度,试验以4个典型玉米杂交组合为研究对象,在不同浓度NaCl处理下,对玉米萌发和幼苗期根苗性状进行了分析。结果表明:玉米的发芽力、种子活力、幼苗高度、幼苗鲜重和根长、根鲜重随NaCl浓度的升高均呈下降趋势,并且同一玉米品种各生理性状所表现的耐盐反应有所不同。各项测定指标与对照之间达到显著或极显著差异水平的NaCl处理浓度为8‰。玉米幼苗期耐盐性鉴定的适宜水平为相对恒定的8‰NaCl浓度。     

松树脂溃疡病菌的分子检测

松树脂溃疡病(Fusarium circinatum)为美国、南非等国外针叶树上发生的一种危险性林木病害(Storer et al.,1994;Viljoen et al.,1994).该病害常引起寄主树干流脂溃疡、雌花和球果坏死、种子变质以及苗木枯死.其病原菌可随种子、苗木、病木木材、媒介生物以及黏附土壤进行远距离传播.日本1989年(Kobayashi et al.,1989)、墨西哥1991年(Guerra et al.,1991)、南非1994年(Viljoen et al.,1994)、智利2001年(Wingfield et al.,2001)等地相继发现有松树脂溃疡病为害,该病害在世界各地呈现出迅速蔓延之势.     

高通量测序技术分析进境高粱种子的真菌多样性

[目的]利用高通量测序技术对进口美国和澳大利亚的高粱种子真菌多样性进行分析,以期为筛查进口高粱携带真菌种类及检疫风险的评估提供科学依据。[方法]收集美国和澳大利亚的高粱种子24份,提取DNA,对ITS1区进行Illumina Hiseq高通量测序,通过真菌通用数据库(UNITE database)及自行构建的高粱病原真菌核心数据库,应用USEARCH 10.0软件对高通量测序数据进行生物信息学分析。[结果]质量控制后得到1 794 895条优化序列,聚类得到901个OTU(operational taxonomic units),测序已覆盖样品中绝大部分的真菌类群。多样性分析表明:2个国家的高粱种子携带的真菌数量相对稳定,但2个国家的高粱种子真菌群落结构差异显著,美国高粱主要真菌群落分布比澳大利亚均匀。2个国家进口高粱种子携带的真菌种类(属水平上)有:链格孢属、曲霉属、隐球菌属、附球菌属、镰刀菌属、戴维氏属、汉纳酵母属、球梗孢属、茎点霉属、耐干霉菌属、尾孢菌属、枝孢属、麦角菌属、旋孢腔菌属、刺盘孢属、弯孢霉属等。采用通用数据库有29个OTU比对到种水平;而采用高粱病原真菌核心数据库有47个OTU比对到种水平。[结论]通过高通量测序技术全面筛查进境高粱携带的病原真菌种类,一次性检出了多种重要的高粱病原真菌;并且构建高粱核心病原真菌数据库,可以显著提高鉴定到种的准确率,为快速筛查高粱病原真菌提供科学依据,为口岸科学评估进口高粱检疫风险提供技术支持。