齿兰环斑病毒RT-qPCR检测方法的建立

【目的】针对齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, ORSV)建立快速、有效检测方法,对于保障兰花规模化生产有重要意义。【方法】以齿兰环斑病毒为材料,根据NCBI上已登录的齿兰环斑病毒外壳蛋白(coat protein, cp)基因序列分析其序列保守区,使用Primer Premier 5.0设计反转录荧光定量PCR引物及TaqMan荧光探针,建立检测齿兰环斑病毒的一步法RT-qPCR。构建齿兰环斑病毒cp基因克隆质粒,并以该质粒作为标准品进行荧光定量PCR标准曲线测定;以齿兰环斑病毒、建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)的病毒RNA为模板进行一步法RT-qPCR特异性检测;以10倍倍比稀释的cp基因质粒为模板进行灵敏性检测;用该法对大田18个兰花样品进行齿兰环斑病毒感染情况监测。【结果】齿兰环斑病毒一步法RT-qPCR检测法仅检出齿兰环斑病毒阳性模板,其余模板检测结果为阴性,说明检测方法具有特异性;该方法能够检测到的齿兰环斑病毒cp基因最低拷贝数...     

大蕉特异性分子靶标的开发及其评价

【目的】由于香蕉高度不育和无性繁殖，经过长期的进化，导致许多资源来源不清晰。开发大蕉资源特异性分子靶标，为香蕉资源鉴定和遗传改良提供技术支撑。【方法】利用香蕉线粒体cox2/2-3基因序列，根据大蕉在该序列的特异性位点进行分子靶标设计，采用37份大蕉，以及香牙蕉、粉蕉、贡蕉、尖苞片蕉（Musa acuminata）、长梗蕉（M. balbisiana）、芭蕉（M. basjoo）以及阿宽蕉（M. itinerans）等共计59份其他类型香蕉资源进行鉴定筛选，获得特异性鉴定大蕉的分子靶标DcR/DcF，并进行评价。【结果】通过对共计96份香蕉资源的检测，发现37份大蕉均出现634 bp特异性条带，香牙蕉、粉蕉、贡蕉未出现该条带。在应用该标记对野生蕉检测中发现仅有阿宽蕉出现该特异性条带，长梗蕉、尖叶蕉、芭蕉均未出现该特异条带，同时大蕉和阿宽蕉的杂交后代出现了该特异条带。【结论】成功开发了一个大蕉特异性分子靶标DcR/DcF，可以在栽培蕉中特异性地鉴定大蕉，并具有快速、简便、准确的特点，该技术对香蕉种质资源鉴定、新品种选育等具有重要的应用价值。     

三种处理对粉掌盆花模拟贮运效果的研究

以粉掌盆花为试材,进行硫代水杨酸（SA）、硫酸银（STS）和1-甲基环丙烯（1-MCP）三种处理,通过测定粉掌盆花叶片的相对电导率、叶绿素荧光参数、丙二醛含量、相对含水量等生理指标,研究模拟贮运黑暗条件下三种处理对粉掌盆花的保鲜效果。试验结果表明,随着处理天数的增加,经SA、STS、1-MCP处理的粉掌叶片相对电导率均有所增加,叶绿素荧光参数Fo、Fm和Fv/m均有先下降后上升的趋势,MDA含量则不断增加,相对含水量减少。与对照相比,SA、STS和1-MCP均有利于延长粉掌盆花的寿命,其中1-MCP处理对粉掌盆花的保鲜效果最好。     

一步法 RT-LAMP-HNB 检测兰花建兰花叶病毒和齿舌兰环斑病毒方法的建立

【目的】全世界兰花病毒有 50 余种，建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）和齿舌兰 环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV）是其中最常见的两种病毒。目前仍没有有效的措施能够控制病毒 病，因此建立针对病毒的高效监测、检测方法，对控制兰花病毒感染具有至关重要的意义。【方法】以兰花病 毒 CymMV 和 ORSV 为试验材料，采用反转录 - 环介导等温扩增方法（RT-LAMP）进行病毒 RNA 的扩增，从而 建立 CymMV 和 ORSV 的快速检测方法。分别根据两种病毒的 cp 基因序列保守区设计 RT-LAMP 引物，在一步 法 RT-LAMP 反应体系中加入羟基萘酚蓝（HNB，终浓度 200 µmol/L）作为扩增产物指示剂，不需开盖进行凝胶 电泳检测，便可直接根据体系颜色变化判读反应结果。【结果】利用该检测方法能够在 2 h 测出样品中是否存在 CymMV 和 ORSV 病毒 RNA，其灵敏度是 RT-PCR 的 10 倍。对 20 株田间样品进行一步法 RT-LAMP-HNB 检测， 根据田间检测结果显示，CymMV 检出率为 70%，ORSV 检出率为 55%，与 RT-PCR 结果保持一致，该法适用于 田间样品检测。【结论】建立的一步法 RT-LAMP-HNB 是一种灵敏、快速、特异、便捷的 CymMV 和 ORSV 检 测方法，仅需要简单控温设备如水浴锅便可进行核酸扩增，适用于在基层或不便利地区推广使用。