兰花两种主要病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据建兰花叶病毒(Cymbidiummosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspot virus,ORSV)这两种主要兰花病毒的保守序列设计特异性引物,在CymMV和ORSV单一RT-PCR优化体系的基础上,建立了同时检测CymMV和ORSV的双重RT-PCR检测方法。此方法可特异性地从感染CymMV和ORSV的样品中扩增出2条目的带,即CymMV(781 bp)和ORSV(588 bp)。扩增产物测序表明,CymMV扩增产物与GenBank中登陆的分离物核苷酸同源性为84%~97%,ORSV扩增产物与GenBank中其它分离物的核苷酸序列同源性为98%~99%。运用该方法对随机抽取的田间样品及组培苗样品进行检测,都得到了特异性扩增条带,其灵敏度达到了10-5。     

一步法 RT-LAMP-HNB 检测兰花建兰花叶病毒和齿舌兰环斑病毒方法的建立

【目的】全世界兰花病毒有 50 余种，建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）和齿舌兰 环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV）是其中最常见的两种病毒。目前仍没有有效的措施能够控制病毒 病，因此建立针对病毒的高效监测、检测方法，对控制兰花病毒感染具有至关重要的意义。【方法】以兰花病 毒 CymMV 和 ORSV 为试验材料，采用反转录 - 环介导等温扩增方法（RT-LAMP）进行病毒 RNA 的扩增，从而 建立 CymMV 和 ORSV 的快速检测方法。分别根据两种病毒的 cp 基因序列保守区设计 RT-LAMP 引物，在一步 法 RT-LAMP 反应体系中加入羟基萘酚蓝（HNB，终浓度 200 µmol/L）作为扩增产物指示剂，不需开盖进行凝胶 电泳检测，便可直接根据体系颜色变化判读反应结果。【结果】利用该检测方法能够在 2 h 测出样品中是否存在 CymMV 和 ORSV 病毒 RNA，其灵敏度是 RT-PCR 的 10 倍。对 20 株田间样品进行一步法 RT-LAMP-HNB 检测， 根据田间检测结果显示，CymMV 检出率为 70%，ORSV 检出率为 55%，与 RT-PCR 结果保持一致，该法适用于 田间样品检测。【结论】建立的一步法 RT-LAMP-HNB 是一种灵敏、快速、特异、便捷的 CymMV 和 ORSV 检 测方法，仅需要简单控温设备如水浴锅便可进行核酸扩增，适用于在基层或不便利地区推广使用。     

利用ELISA检测两种兰花病毒的研究

建立了三抗夹心酶联免疫吸附法(TAS-ELISA)检测建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)和双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)的方法.共检测了浙江省内139个兰科样品和8个百合科样品,结果表明有31.7%的兰花检出CymMV,有28.8%的兰花检出ORSV.根据病毒外壳蛋白基因上下游保守序列设计了检测ORSV的引物,参照周国辉报道设计了检测CymMV的引物并对人工接种两种病毒的兰花进行了逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测,结果表明,RT-PCR检测结果与ELISA结果相一致,进一步证实本研究建立的TAS-ELISA,DAS-ELISA方法稳定可靠,重复性好,可应用于兰花上CymMV和ORSV两种病毒的早期诊断和检测.     

多重RT-PCR检测蝴蝶兰3种病毒CymMV、ORSV和CMV

根据建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,Cym MV)、齿兰轮斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)和黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)3种病毒外壳蛋白基因序列保守序列设计特异性引物,以病毒侵染的蝴蝶兰总RNA反转录的c DNA为模板进行扩增,建立了三重RT-PCR同时检测该3种病毒的方法。Cym MV、ORSV和CMV 3种病毒特异扩增的片段分别为561、433、306 bp。用该方法对17个疑似病毒感染的蝴蝶兰样品进行检测,结果13个材料检测出Cym MV特异带,2个材料检测出ORSV病毒特异带,1个材料检测出CMV病毒特异带,1个材料同时检测出Cym MV和ORSV病毒2条特异带,所检测的17个蝴蝶兰材料未发现3种病毒复合侵染的情况。     

文心兰3种主要病毒多重RT-PCR检测体系的建立

根据GenBank中已发表的建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)、齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)和菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus,BYMV)外壳蛋白(CP)基因序列保守区域分别设计特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能同时检测文心兰3种病毒的多重PCR检测体系。该体系能够一次扩增出CyMV、ORSV和BYMV的特异片段,其大小分别是551、325和212bp。测序结果表明,3种病毒序列与相应的参考序列相似性均达98%以上。灵敏度测定结果表明,从相当于或大于10-2 mg的感病植物组织中能够检测到这3种病毒。     

3种热带兰感染2种病毒的症状探讨

建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus,CymMV）和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）是危害海南兰花最普遍的2种病毒。CymMV侵染蝴蝶兰后引发黄化斑、坏疽凹陷斑、畸形生长等多种症状;侵染石斛兰引发花叶、黄化斑、全叶黄化或红化、契形坏死、疱状突出等症状;侵染文心兰引发花叶、黄化、坏死、畸形生长等症状。ORSV的症状种类则相对简单,蝴蝶兰上引发环斑、系统性黄化、凹陷坏死、疱状突出等症状;文心兰上主要表现花叶;石斛兰上未检测到ORSV。     

天津地区番茄病毒病发生情况调查及其毒源ELISA检测

对采自天津5个区县的255份番茄样品进行了双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)检测。检测结果表明,在这255份样品中,至少217份感染了所检测病毒,其中,感染番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,To MV)、蚕豆萎蔫病毒1、2号(Broad bean wilt virus 1、2,BBWV-1、2)、番茄斑萎病毒(TSWV)的样品分别为53.33%,53.33%,20.39%,14.12%,9.41%,0.39%。在检测呈阳性的217份样品中病毒单独侵染率为32.15%,复合侵染率为52.94%,这些数据表明在番茄上病毒复合侵染现象相当严重,其中受2种病毒复合侵染率高达40.39%,而受3种病毒复合侵染率达12.55%。     

云南部分兰花病毒病的病害调查及病原鉴定*

 对云南部分兰花种植区的文心兰、蝴蝶兰、大花惠兰上发生的病毒病进行了调查与病原鉴定。兰花感染病毒后,主要以在叶片形成黑褐色的坏死斑为主。在文心兰不同品种中,T系列的病毒病发病率最高。经电子显微镜、血清学和RT-PCR等方法综合鉴定,确定危害云南兰花的主要病毒为建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV ) 和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV ),其中CyMV为优势种,有时出现CyMV 和ORSV复合侵染的情况。     

福建建兰病毒病调查研究

2014-2015年,对福建主要建兰种植基地进行病毒病危害情况调查。结果表明,福建建兰病毒病症状多以斑驳花叶型最为普遍。调查还发现,建兰的病毒病发病率与龄期呈正相关,不同品种间略有差异。应用RT-PCR方法鉴定,确定危害福建建兰的病毒主要为齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)、建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus,BYMV),其中ORSV为优势种,有时出现ORSV和CyMV二者复合,或ORSV、CyMV和BYMV三者复合感染。     

广东兰花两种主要病毒的检测

采用双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)对44个兰花病样分别检测建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV )和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV),结果显示,有59.1%的兰花检出CyMV,36.4%的兰花检出ORSV,22.7%的兰花复合感染了CyMV和ORSV.采用一步逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对24个兰花病样进行检测,结果有83.3%的兰花检出 CyMV,75%的兰花检出ORSV,66.7%的兰花复合感染了CyMV和ORSV,可见RT-PCR检测灵敏度高于ELISA.     

双重一步法RT-PCR检测2种主要兰花病毒

[目的]研究建兰花叶病毒（CymMV）和齿兰环斑病毒（ORSV）双重一步法RT—PCR检测方法,为病毒的早期快速诊断提供技术支持。[方法]根据2种病毒的外壳蛋白基因的保守序列分别设计两对特异性引物,并进行双重与单一RT—PCR对比试验。[结果]结果在健康蜘蛛兰被人工接种病毒后第10天和第21天用一步法RT-PCR方法分别获得CymMV和ORSV与预期相符的约764和946bp扩增产物务带;且双重一步法RT—PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,出现两务与单一RT—PCR产物相对应的清晰务带,获得较理想的检出效果;扩增产物的核酸序列经BLAST分析,同源性均在85％以上,证实了检测结果的准确性。[结论]该方法具有更加灵敏、特异、快速和简便的特点,适合于两种主要兰花病毒的同时快速检测。     

蝴蝶兰2种病毒的同步检测及其CP融合反义表达载体构建

【目的】建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)是侵染蝴蝶兰最主要的2种病毒,给蝴蝶兰产业造成巨大经济损失。本文建立了快速检测这2种病毒的方法,并为培育同时抗CyMV和ORSV的蝴蝶兰新品种奠定基础。【方法】根据2种病毒CP基因序列设计了2对特异性引物,运用RT-PCR方法同时检测这2种病毒,利用反义RNA技术构建2种病毒CP基因的融合表达载体。【结果】利用设计的特异性引物检测12株蝴蝶兰样品,有25%同时检测出2种病毒,在同一PCR反应体系中,扩增出2个目的条带清晰无杂带。从感病蝴蝶兰叶片总RNA中克隆出CyMV CP基因的125 bp片段和ORSV CP基因的164 bp片段。将CyMV的CP基因片段以3’→5’方向与表达载体p CAMBIA1300连接,命名为p CAMBIA1300-CyMV,经酶切及菌落PCR鉴定可获得125 bp的小片段;再将ORSV的CP基因片段以3’→5’方向与p CAMBIA1300-CyMV连接,命名p CAMBIA1300-CyMV-ORSV,经酶切及菌落PCR鉴定可获得289 bp的片段。【结论】所设计的2对特异性引物能够在同一PCR体系中快速高效地检测出CyMV和ORSV,含2种病毒CP基因的反义融合表达载体构建成功。     

建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp基因hpRNAi表达载体的构建

为了构建建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)复制酶RdRp基因hpRNAi的表达载体,根据GenBank中CymMV和ORSV RdRp基因的保守序列设计引物,以蝴蝶兰温室生产中两种病毒的分离物为模板,成功扩增了两种病毒的RdRp基因片段。扩增的这两种病毒的RdRp基因与数据库中病毒序列同源性均在98%以上。利用融合PCR将两种病毒片段串联在一起,然后通过Gateway技术的BP反应和LR反应将融合产物插入到基因沉默表达载体pHellsgate12中,成功构建了可同时抗建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的发夹结构RNA干扰载体,为兰花多抗基因工程育种奠定了基础。     

球根鸢尾3种主要病毒多重RT-PCR检测体系的建立

根据GenBank中已发表的鸢尾轻花叶病毒(Iris mild mosaic virus,IMMV)、水仙潜隐病毒(Narcissus latent virus,NLV)和菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus,BYMV)外壳蛋白(CP)基因序列保守区域分别设计特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能同时检测球根鸢尾3种病毒的多重PCR检测体系。该体系能够一次扩增出IMMV、NLV和BYMV的特异片段,其大小分别是770bp、266bp和186bp。测序结果表明,3种病毒序列与相应的参考序列相似性均达98%以上。灵敏度测定结果表明,从相当于或大于10-2 mg的感病植物组织中能够检测到这3种病毒。     

温室蝴蝶兰病毒病综合防治技术

根据蝴蝶兰常见病毒的危害特性和侵染方式,以建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)2种病毒为例总结温室蝴蝶兰病毒病防治技术,以达到有效控制蝴蝶兰病毒在温室中的传播、促进蝴蝶兰正常生长的目的。     

温室蝴蝶兰病毒病综合防治技术

根据蝴蝶兰常见病毒的危害特性和侵染方式,以建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)2种病毒为例总结温室蝴蝶兰病毒病防治技术,以达到有效控制蝴蝶兰病毒在温室中的传播、促进蝴蝶兰正常生长的目的。     

复合侵染的马铃薯花叶病病原诊断

2015年在浙江宁波发现感病马铃薯植株具有马铃薯花叶病的典型症状,即植株矮化,叶片花叶、皱缩。透射电镜负染色发现,其叶片中含有长度约600~900和400 nm的线状病毒粒子。超薄切片发现,病毒主要集中在叶肉细胞,产生的内含体包括病毒样粒子聚集体、串珠-片层内含体和柱状内含体。串珠-片层内含体代表马铃薯X属特征,柱状内含体代表马铃薯Y属特征,表明可能存在复合侵染,并且2种不同病毒引起的内含体被发现于同一细胞。使用马铃薯Y属病毒通用引物以及针对马铃薯X病毒设计的特异性引物进行RT-PCR扩增及测序,明确其为马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)复合侵染。     

齿兰环斑病毒外壳蛋白的原核表达、抗体制备及检测应用

齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspot virus,ORSV)是感染兰花的主要病毒之一.用RT-PCR方法从感染ORSV兰花中克隆到该病毒的477 bp外壳蛋白基因(CP),外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建重组原核表达载体pET-32a-CP;将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,Ni2+-NTA亲和柱纯化获得分子量约为37 ku含硫氧还蛋白的融合蛋白.以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备ORSV外壳蛋白的多克隆抗体,并用制备的多抗建立了可靠、灵敏、特异的检测ORSV的免疫捕获RT-PCR及dot-blot ELISA方法,为该兰花病毒病的诊断、兰花抗病育种和脱毒苗的建立打下了基础.     

建兰花叶病毒TGB1和TGB2基因的原核表达

建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus,CymMV）是严重危害兰科植物的主要病毒之一。本研究根据NCBI登录序列号（AB197937）的CymMV-TGB1, TGB2基因分别设计特异性引物,采用逆转录聚合酶链式反应（RT PCR）方法从感染CymMV蝴蝶兰病叶中扩增TGB1,TGB2基因,并将目的基因插入pGEX-4T3中,构建相应的原核表达载体。将表达载体转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后成功表达出目的蛋白;SDS-PAGE及Western blot检测证实目的蛋白分别是融合GST的CymMV TGB1和TGB2蛋白。两个蛋白的表达为下一步抗体制备以深入开展CymMV TGB1和TGB2功能研究奠定了基础。