富硒乳酸蛋白粉对乳酸菌生物学特性影响的研究

为初步研究富硒乳酸蛋白粉对乳酸菌生物学特性影响,选择乳酸乳球菌、鼠乳杆菌、嗜酸乳杆菌作为受试菌种,进行蛋白粉对乳酸菌生长增殖影响试验、耐温性试验、酸碱耐受性试验和胆盐耐受性试验以及对乳酸菌产酸的影响试验等。结果显示:蛋白粉具有促进乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌增殖的作用,富硒乳酸蛋白粉对乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌的最适浓度分别为1、3和4mg/mL,乳酸蛋白粉对其的最适浓度分别为3、6和9mg/mL;蛋白粉还一定程度的提高了乳酸菌的酸碱耐受性、耐温性和耐胆盐性;还提高了乳酸菌的产酸量。     

猪链球菌噬菌体SMP裂解酶在乳酸乳球菌中的表达及活性研究

猪链球菌（Streptococcus suis,SS）烈性噬菌体SMP的宿主谱窄,制约了其临床应用潜力。研究发现,由噬菌体编码的裂解酶（LySMP）可有效拓宽其裂解谱。本研究以SMP基因组DNA为模板,扩增获得SMP裂解酶基因,将其克隆至质粒pNZ8148中,电转化乳酸乳球菌NZ9000,获得重组乳酸乳球菌NZ9000（pNZ8148-LySMP）,经Nisin诱导可表达LySMP。浊度递减实验结果显示,所表达的LySMP对7株猪链球菌2型菌株和猪链球菌9型菌株有较高的裂解活性,浊度下降可达30%~77%。表明利用NICE表达系统及pNZ8148表达载体在乳酸乳球菌中可实现猪链球菌噬菌体裂解酶的活性表达,为开展LySMP的应用研究提供了可能。     

乳酸乳球菌电击转化方法的优化

乳酸菌NICE系统是食品级表达系统，本实验以该系统的表达载体pNZ8148和宿主菌NZ9000为研究对象，对电击转化方法进行了优化。结果表明，在培养基中加入2.5%甘氨酸，收集OD₆₀₀值为0.3的细胞、用配方I[（洗涤液I:蔗糖0.5 mol·L?1+甘油10%；洗涤液II:蔗糖0.5 mol·L?1+甘油10%+EDTA50 mmol·L?1）]洗涤细胞，再转入0.2 μg质粒，利用2.5 kV电压和0.2 cm电击杯进行电击转化，恢复培养1.5 h后转化效率最高，达1.6×108 CFU·μg?1。本实验为乳酸乳球菌NZ9000的电击转化参数提供了数据参考，为基于乳酸菌NICE系统的深入研究奠定了基础。     

矿物质复合微量元素对乳酸菌生长及生物学特征的影响

乳酸菌作为肠道益生菌群,在维持肠道内菌群平衡及消化运动功能上起到重要作用。为了研究天然矿物微量元素复合制剂对乳酸菌的生长及生物学特性的影响,选择保加利亚乳杆菌、李糖鼠乳杆菌、乳酸乳球菌和嗜酸乳杆菌的标准菌株作为试验菌种,对乳酸菌的增殖、酸碱耐受性、温度耐受性、细菌生长曲线及其代谢产物的抑菌效果等进行试验。结果表明:矿物粉对保加利亚乳杆菌、李糖鼠乳杆菌、乳酸乳球菌和嗜酸乳杆菌均起到增菌作用,其最适作用浓度分别为0.1、0.25、0.25和0.5g/mL,矿物质微量元素对乳酸菌的酸碱耐受性、温度耐受性及细菌抑菌作用等具有一定的提高效果。     

表达猪轮状病毒VP4基因重组乳酸球菌表达载体构建及免疫原性分析

 【目的】构建猪轮状病毒主要保护性抗原VP4基因的重组乳酸乳球菌口服疫苗,为猪轮状病毒的防治提供有效方法。【方法】将猪轮状病毒免疫保护性抗原基因VP4主要结构功能区定向插入乳酸菌表面表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌NZ9000,构建了pNZ8112/NZ9000乳酸乳球菌表面表达系统。通过SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光方法鉴定,以此活菌系统口服免疫6～8周龄Balb/c小鼠,测定了免疫动物的局部体液免疫和系统免疫应答。【结果】证明插入的外源基因在菌体表面得到了正确表达,表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌免疫动物后,分别在粪便、泪液和阴道洗液中检测到了特异性分泌型IgA抗体和在血液中检测到了IgG抗体的存在;体外细胞中和试验结果表明,血清抗体对猪轮状病毒的中和效价为1﹕40。【结论】表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌口服免疫动物能够产生良好的局部和系统体液免疫应答而且具有免疫中和效力。     

猪乳铁蛋白基因的克隆及其重组乳酸菌表达系统构建

根据猪乳铁蛋白N端基因序列及表达载体质粒的基因融合特点,设计一对引物,以泌乳3日龄母猪乳腺组织RNA为模板,进行RT-PCR,获得含有猪乳铁蛋白基因N端1 077 bp目的片段,将其与表达载体质粒pPG612.1进行连接,通过转化进入宿主菌JM109细胞内,通过质粒提取、PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定分析,表明猪乳铁蛋白N端PLFN基因已成功插入到表达载体质粒中,获得了猪乳铁蛋白干酪乳杆菌表达载体质粒pPG612-PLFN。将获得的重组质粒再分别电转化入干酪乳杆菌ATCC393、植物乳杆菌KLDS1.0344、副干酪乳杆菌KLDS1.0652及戊糖乳杆菌KLDS1.0413中,获得表达猪乳铁蛋白基因的多种重组乳酸菌分别为pPG612-PLFN/L.casei,pPG612-PLFN/L.plantarum,pPG612-PLFN/L.paracasei和pPG612-PLFN/L.pentosus.,为猪乳铁蛋白的乳酸菌表达及重组乳酸菌抗菌制剂的制备奠定了基础。     

干发酵香肠中乳酸菌发酵剂的选择

5种乳酸菌 (植物乳杆菌 6 0 0 3、嗜酸乳杆菌 6 0 0 5、弯曲乳杆菌 6 0 31、干酪乳杆菌 6 0 33和戊糖片球菌10 196 )分别与葡萄球菌 10 14 5混合作为干发酵香肠的发酵剂 ,测定并比较不同发酵剂的干发酵香肠的产品质量 ,结果表明 :5种乳酸菌中 ,植物乳杆菌 6 0 0 3和干酪乳杆菌 6 0 33是较适合制作干发酵香肠的乳酸菌发酵剂 ,而且植物乳杆菌 6 0 0 3具有最强的生长及产酸能力     

饲用复合微生物制剂中乳杆菌计数培养基的初步研究

为了便于准确计数乳酸菌产品中的活菌数,保障微生物活菌制剂产品的质量,根据嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌对不同碳水化合物的选择性利用,设计了几种乳酸菌的选择性计数培养基,并对其计数效果进行了验证.结果表明,利用MRS培养基能够检测嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌2种菌的混合制品总菌数,而使用山梨醇-MRs培养基能够选择性地计数嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌混合制品中的植物乳杆菌数,这样可以分别得到2类乳酸细菌的数量,为保障产品质量的稳定性提供了合适的检测方法.     

健康家兔肠道中乳酸菌的分离鉴定

本试验选用MRS、MRS+10%家兔硬粪浸出液和MRS+10%泡菜汁3种选择培养基,对健康家兔肠道的乳酸菌群分别进行需氧和厌氧培养,根据可培养细菌菌落特征、染色特性、显微镜形态观测,共分离出7株乳酸菌株,其中需氧菌2株,厌氧菌5株。结合生化试验初步鉴定,需氧菌株分别为乳酸乳球菌和短乳杆菌,厌氧菌株分别为嗜酸乳杆菌,嗜粪乳杆菌,肠乳杆菌,乳酸乳杆菌和弯曲乳杆菌。本实验为弄清健康家兔肠道的有益菌群,以便下一步制作更易于在畜禽的肠道中定植存活的复合动物微生态制剂做准备。     

重组嗜酸乳杆菌S层蛋白拮抗H_9N_2禽流感病毒对树突状细胞侵袭的研究

[目的]乳酸杆菌S层蛋白可结合树突状细胞特异性细胞间黏附分子3捕获的非整合蛋白(DC-SIGN)受体调节树突状细胞的成熟和分化,禽流感病毒同样可以通过与DC-SIGN的结合促进病毒在人源树突状细胞内的复制。为了探究S层蛋白是否竞争性与DC-SIGN结合,进而拮抗禽流感病毒侵袭树突状细胞,本试验构建表达嗜酸乳杆菌ATCC4356 S层蛋白的重组大肠杆菌,并探究重组S层蛋白抑制H9N2禽流感病毒侵袭树突状细胞的影响。[方法]以嗜酸乳杆菌ATCC4356的基因组为模板扩增S层蛋白基因并携带GST标签,构建重组质粒p GEX-4t-2-S并转化E.coli Rosetta-gami2(DE3),18℃低温诱导重组S层蛋白的表达,提取S层蛋白后经亲和层析进一步纯化;用纯化的重组S层蛋白提前作用于小鼠和鸡骨髓源树突状细胞,随后感染H9N2禽流感病毒,检测S层蛋白对禽流感病毒感染的拮抗作用。[结果]电泳结果显示成功扩增出1 295 bp的带有同源臂的嗜酸乳杆菌ATCC4356 S层蛋白基因;酶切得到2条带,分别为载体骨架4 951 bp,目的基因1 263 bp,表示成功构建p GEX-4t-2-S质粒,并且测序结果正确;电泳结果显示转化子中带有S层蛋白的基因,表明构建的质粒成功转入到DE3中并成功表达;电泳结果显示在相对分子质量70×103处有1条带,灰度分析表明亲和层析纯化后得到了纯度为95%的重组S层蛋白,产量为每1011CFU大肠杆菌11.9 mg;流式细胞检测结果证明S层蛋白能够使入侵小鼠和鸡树突状细胞中的H9N2病毒量减少25%~30%,实时荧光定量PCR结果表明HA、NA、NP和PB1基因的相对表达水平均达20%以上。[结论]重组大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)表达的S层蛋白能够有效地拮抗H9N2亚型禽流感病毒对小鼠和鸡树突状细胞的侵袭,为预防禽流感疫病提供新思路。     

乳酸乳球菌NICE系统食品级分泌表达载体pRNV48的构建及铜绿假单胞菌融合外膜蛋白的表达

乳酸菌NICE系统是目前较理想的可控制蛋白质生产的食品级诱导表达系统,而乳酸菌分泌表达异源蛋白比细胞质表达更优越。本研究将以pVE5524为模板PCR扩增的1.5 kbSPUsp45-NucA-CWAM6-t1t2基因克隆到食品级细胞内诱导表达载体pRNA48上,构建成食品级细胞壁锚定表达载体pRNV48,与宿主菌L.lactisNZ9000共同构成乳酸乳球菌食品级细胞壁锚定诱导表达系统。为检测该系统的功能,将铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H克隆进pRNV48中,并检测了OprF/H的表达量和免疫原性。     

PEDV ps420片段乳酸乳球菌表达及免疫中和活性检测

将猪流行性腹泻病毒LJB/03株S基因上编码中ps420(1 495～1 916 bp)基因片段插入乳酸乳球菌pNZ8112中,构建了重组表达载体pNZ8112-ps420,将其电转化入乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000,获得了表达猪流行性腹泻病毒S基因ps420的重组乳酸乳球菌,经乳链菌肽(...     

Cloning of Bile Salt Hydrolase Gene and Its Expression in Lactic Acid Bacteria

According to the sequence of the bile salt hydrolase (BSH) gene of Bifidobacterium and the restriction enzyme cutting sites of expression vector pNZ8148, primers were designed and the bile salt hydrolase (BSH) gene was gotten from Bacillus bifidus ATCC 29521 by PCR. BSH gene was inserted into lactic acid bacteria expression vector pNZ8148 to construct the recombinant pNZ8148-BSH. The recombinant pNZ8148-BSH was transferred into lactic acid bacteria NZ9000 with electrotransformation method. And the recombina...     

狼山鸡消化道乳酸菌的分离·鉴定以及生物学特性研究

[目的]分离和鉴定狼山鸡消化道乳酸菌,为开发新型禽用微生态制剂提供依据。[方法]利用厌氧菌分离技术,从狼山鸡肠道中分离乳酸菌,通过形态、生理生化特性、16S rRNA基因序列测定以及同源性分析对其进行鉴定,并对菌株进行耐酸性、抗菌活性等筛选。[结果]分离到5株乳酸菌LCr-01、LCr-02、LCe-01、LCe-02、LCe-03,经过生理生化试验、16S rRNA基因序列测定以及同源性分析,初步鉴定植物乳杆菌、卷曲乳杆菌、德氏乳杆菌以及嗜酸乳杆菌。其中,LCr-02具有较强的耐酸性和抗菌活性。[结论]筛选到的5株菌乳杆菌中LCr-02具有较强的耐酸性与抗菌活性。     

益生菌酪酸菌CB-7的生物学特性研究

[目的]考察酪酸菌CB-7的生物学特性。[方法]对菌株的耐酸、耐胆盐、耐高温性能及其对动物肠道致病菌大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌的抑制作用,对肠道有益菌嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和粪链球菌生长的促进作用进行了研究。[结果]酪酸菌CB-7在pH值为3.0的培养基中37℃培养4 h后,存活率达90.0%;在含0.3%牛胆盐的培养基中37℃培养4 h后,存活率达到91.8%;经90℃水浴处理10 min、100℃水浴处理5 min后,存活率均在90.0%以上;对大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌均有显著的抑制作用,其发酵提取物可显著促进嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和粪链球菌的生长。[结论]酪酸菌CB-7具有较强的耐酸、耐胆盐和耐高温性能,对肠道致病菌具有较强的抑制作用,且可显著促进肠道有益菌的生长,因此是一株性能优良的饲用菌株。     

利用组成型表达载体pMG36e电转化乳酸乳球菌ML23的研究

为了探明乳酸菌电转化的最适条件,提高电转化效率,本试验以大肠杆菌-乳酸菌穿梭型质粒pMG36e为载体,以乳酸乳球菌ML23为受体,利用电转化方法研究了受体菌株的生长状态与细胞壁处理方式、质粒浓度、电场强度、复苏培养基组成与复苏培养时间、受体菌株的限制修饰作用对电转化效率的影响。结果表明:含2%甘氨酸和0.5 mol/L蔗糖的MRS培养基培养至对数生长中期的细胞,在电场强度11.0 kV/cm、电阻200Ω、电容25μF下电击转化,转化后细胞在SMRS培养基中培养2 h,获得了较高的电转化效率。采用受体菌株修饰的质粒进行电转化,转化效率又提高了15倍以上,达1.05×105CFU/μg DNA。     

TK酶基因在乳酸乳球菌中的表达

利用乳酸乳球菌nisin诱导基因表达系统(the Nisin Controlled gene Expression system,NICE)表达TK酶基因.采用基因克隆和表达方法,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定.重组质粒测序结果表明,转化到乳酸乳球菌中的TK基因与pWSTK6基因(登录号为EU530625.1)相...     

微生物发酵白酒糟的研究

为探索班图酒香酵母(酵)、枯草芽孢杆菌(枯)、绿色木霉(木)、嗜酸乳杆菌(乳)发酵白酒糟的最佳条件及组合,通过十字交叉法进行拮抗试验,采用厌氧和有氧两种方式发酵,辅以单因子对比试验观察绿色木霉生长情况。结果表明,4种菌之间不存在拮抗效应。有氧发酵比厌氧发酵活菌数含量高,嗜酸乳杆菌和班图酒香酵母发酵第9 d的活菌数最高。嗜酸乳杆菌为有氧发酵的乳+酵+木组最高,比厌氧发酵高一个数量级。班图酒香酵母为有氧发酵的乳+酵组最高,比厌氧发酵提高47.95%。各组枯草芽孢杆菌发酵到第6 d活菌数最高,有氧发酵的乳+枯组最高,比厌氧发酵高11.73%。绿色木霉活菌数均为0。经过单因子对比试验发现绿色木霉不适合发酵白酒糟。