基因表达系统研究进展

随着世界分子生物学的研究不断发展,基因表达技术有了很大的提高。到目前为止,人们已经研究出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白。原核生物表达系统主要有大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统等;真核生物表达系统主要包括酵母表达系统、丝状真菌表达系统等。各种表达系统各具优缺点,对其进行了详细介绍。     

PRRSV结构蛋白GP5的原核表达与鉴定

利用大肠杆菌原核表达系统体外表达猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒的GP5蛋白,可为GP5蛋白的应用奠定物质基础。研究利用PCR技术获得带有酶切位点的gp5基因,通过酶切、连接构建p Cold I-gp5重组质粒,并将其转化至BL21感受态细胞,获得阳性单克隆后诱导其表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western Blotting分析。结果显示,p Cold I-gp5原核表达载体构建成功,该重组载体在大肠杆菌表达系统中能够表达,并且重组蛋白GP5以可溶性蛋白的形式表达。     

犬传染性肝炎病毒Hexon基因原核表达条件的优化与表达蛋白的活性

[目的]为了提高犬传染性肝炎Hexon蛋白基因在大肠杆菌中的表达量,研究Hexon基因蛋白的最佳表达条件和表达蛋白的活性.[方法]在大肠杆菌菌株BL21(DE3)培养过程中,选择诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IFTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件观察对Hexon融合蛋白表达的影响,以确定最佳表达条件,并用Westem-blot检测重组蛋白的生物活性.[结果]大肠杆菌BL21(DE3)在37℃培养2.25h后,添加终浓度为2.0 mmol/L的IPTG,27℃培养8 h,Hexon重组蛋白表达量最高(1.67mg/mL),所表达的重组蛋白能与犬传染性肝炎阳性血清相结合.[结论]在高浓度IPTG诱导和冷培养条件下,Hexon蛋白基因的表达量最高,表达出的重组蛋白具有很好的反应原性,为进一步研究六邻体蛋白的作用机理及亚单位疫苗的研究提供了实验基础.     

重组蛋白Lv-PEN-3的表达纯化与多克隆抗体制备

以凡纳滨对虾的对虾素3（Lv\|PEN\|3）基因作为研究对象,分别进行了大肠杆菌重组表达载体的构建、重组蛋白的诱导表达与亲和纯化,以及多克隆抗体的制备等研究。研究结果显示：Lv\|PEN\|3可以被大肠杆菌正确表达,而且该重组蛋白具有良好的免疫刺激作用,可以刺激家兔产生相应的抗体。     

重组Exendin-4工程菌表达体系优化

为了提高大肠杆菌中重组Exendin-4的表达量,给中试奠定基础,利用单因素试验和正交试验研究了培养基、接种量、诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度、诱导时长以及MgSO4浓度等对重组大肠杆菌生长和融合蛋白表达的影响.结果表明最佳培养基为2×YT,最佳接种量为3％,于细菌对数生长期中后期(OD600约1.5)开始诱导,诱导温度为34℃、乳糖浓度为0.1 g/L,于诱导9h后重组Exendin-4表达量最大.     

大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展

由于DNA重组技术和蛋白组技术的发展与成熟,外源基因表达技术备受关注。其在生物、食品、工业以及医学领域发挥着举足轻重的作用。以原核生物细胞及真核生物细胞作为表达系统,进行目的基因序列的表达以生产蛋白疫苗、核酸疫苗和生物酶制剂等是近年来发酵工业的新型领域。原核和真核表达系统是近年来研究和应用最广泛和最成熟的外源基因表达系统。对近年来关于大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展进行了综述。     

猪型布鲁氏菌omp31基因的原核表达与亲和纯化

以猪型布鲁氏菌基因组作为模板进行基因序列的扩增,利用大肠杆菌原核表达系统进行重组表达,来研究外膜蛋白基因omp31的序列特性与重组表达情况。结果表明：猪型布鲁氏菌omp31基因的开放阅读框序列全长为723 bp,编码240个氨基酸。通过大肠杆菌原核表达,成功表达出了目标重组蛋白,利用GST\|tag亲和柱进行蛋白质纯化,重组蛋白分子量与预期的553 kD相一致。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S-1株GP5蛋白和N蛋白的原核表达

将构建好的表达质粒pET-E和pET-N转化到大肠杆菌BL-21中,通过诱导剂IPTG的诱导,在原核表达系统中得到了高效表达,重组蛋白的分子量分别为39 KDa和31 KDa左右。通过Western-blot蛋白免疫印记法检测蛋白活性,发现两种原核表达重组蛋白均能与PRRSV阳性血清发生反应,具有生物学活性,这就为下一步目的蛋白的纯化、蛋白高级结构的研究以及以GP5和N蛋白为抗原ELISA诊断方法的建立奠定基础。     

大肠杆菌外膜蛋白A在原核表达载体中的克隆表达

对大肠杆菌的外膜蛋白A基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达,为大肠杆菌重组疫苗的构建奠定基础.以大肠杆菌分离株308-2菌株基因组DNA为模板,用PCR法对基因ompA进行扩增,产物与T载体连接,经测序鉴定正确后与表达载体pET32a(+)连接构建表达ompA的重组质粒,将此重组质粒转化入表达宿主E coli Ros...     

GST-Dot4融合蛋白的表达·纯化及鉴定

[目的]为了提高Dotg蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并获得较高纯度的蛋白。[方法]以pGEX—KG—Dot4重组质粒转化EcoliBL21后,用IPTG诱导重组菌表达GST—Dot4融合蛋白,采用SDS—PAGE及WesternBlot法鉴定表达产物,用GlutathioneSepharose4B亲和层析柱分离纯化。[结果]pGEX—KG—Dot4重组表达载体在大肠杆菌中获得高效表达;经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得了高纯度的Dot4融合蛋白;WesternBlot表明,该蛋白可与GST标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。[结论]在大肠杆菌中表达纯化后得到较高纯度的GST—Dot4融合蛋白,为Dot4蛋白的结构、功能及作用机制研究奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达

在大肠杆菌中表达鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV) 奉贤株的主要结构蛋白E。本研究利用RT-PCR方法扩增出E基因, 将其克隆至原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-E。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白成功获得了表达。SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子量为63 ku。Western blot分析表明,该蛋白能与抗His标签的鼠单克隆抗体发生特异性反应。以上结果表明,在大肠杆菌中成功表达了DTMUV主要结构蛋白E。     

MCL-1原核表达载体构建及重组蛋白表达

[目的]构建日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。[方法]通过PCR方法扩增日本蟾蜍皮肤mcl-1开放阅读框,将其插入到原核表达载体pET-28b中。经菌落PCR、DNA限制性内切酶消化筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功。将pET-28b-mcl-1转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE对重组蛋白的表达进行检测。[结果]原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功;重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。[结论]原核表达载体的构建及重组蛋白的表达,为后续MCL-1的纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定了基础。     

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达条件优化、纯化及鉴定

为了将绿色荧光蛋白(GFP)引入大肠杆菌中表达并且进行蛋白的纯化,以提高GFP在大肠杆菌中的表达量,用于传统检测方法的改进及目的菌的应用研究.将人工重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),研究大肠杆菌菌株在温度、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对HIS-GFP融合蛋白表达量的影响.结果:大肠杆菌菌株BL21(DE3)在37℃培养下,D600为0.6～0.8,使用终浓度为0.5 mmol/L的IPTG在15℃诱导培养12 h时,HIS-GFP融合蛋白表达量最高,表达的HIS-GFP融合蛋白可占细菌总蛋白的40％以上.用Ni-IDA亲和层析柱对HIS-GFP融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE分析表明HIS-GFP融合蛋白大小约为68 ku,与预计的分子量大小一致,Western blotting分析表明其能与Anti-HIS单克隆抗体起特异性反应.     

猪繁殖与呼吸综合征GP5蛋白和N蛋白在大肠杆菌中的优化表达和纯化

采用不同的培养基、诱导温度、诱导时间、IPTG诱导剂浓度以及诱导菌浓度等大肠杆菌表达条件,进行了融合蛋白HIS-GP5和HIS-N的优化表达和纯化研究.结果表明:重组质粒转化菌E.coli BL21(DE3)在含0.3 mmol/L IPTG的TB培养基中,20℃诱导表达14 h时融合蛋白表达量最高,经纯化得到了HIS-GP5和HIS-N融合蛋白.SDS-PAGE电泳分析表明,纯化的蛋白纯度大于95%.     

金黄色葡萄球菌Coa基因的克隆、表达及生物活性检测

[目的]克隆金黄色葡萄球菌血浆凝固酶(Coa)基因,并在大肠杆菌中进行融合表达,分析重组蛋白的生物活性.[方法]用PCR法扩增金黄色葡萄球菌Coa基因,构建Coa基因原核表达载体pET32a(+)/coa,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,采用SDS-PAGE法分析重组蛋白的表达水平;将重组蛋白纯化后,测定其...     

小麦选择性自噬关键基因NBR1的原核表达

自噬参与了动植物的生长、发育、衰老和逆境胁迫响应等过程。NBR1是选择性自噬的底物受体之一,其识别泛素化的特定蛋白底物并通过与自噬膜上的ATG8互作引导底物进入自噬降解过程。在前期克隆了两个小麦NBR1基因的基础上,本研究通过常规的分子克隆技术构建了两个基因的原核表达载体并将其转化到大肠杆菌中,利用SDS-PAGE方法鉴定了两个NBR1基因在大肠杆菌中的表达情况。结果表明,导入大肠杆菌的两个小麦NBR1均能够被IPTG诱导表达;表达重组蛋白两端含有His(6)标签,其表观分子量与理论分子量基本一致;重组蛋白在诱导后2 h即表现较高的表达量,并在诱导后4 h达到最高的表达量。研究结果为后续小麦NBR1蛋白的纯化、抗体的制备以及该蛋白的互作性质、表达特征等功能研究工作奠定了基础。     

集胞藻PCC6803中α-酮戊二酸脱羧酶的原核表达分析

【目的】α-酮戊二酸脱羧酶(α-ketoglutaric acid decarboxylase,α-KGD)是蓝细菌三羧酸循环途径中的一个关键酶。试验旨在优化集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白的原核表达方法,并对不同表达方法获得的重组sll1981蛋白进行活性测定。【方法】利用分子生物学技术构建含有sll1981基因的多种表达载体,通过SDSPAGE分析这些表达载体在大肠杆菌表达系统中的表达和可溶性情况,利用Ni-NTA亲和层析分离纯化重组sll1981蛋白,然后通过酶偶联法测定重组sll1981蛋白的催化活性。【结果】含有sll1981基因的不同表达载体在大肠杆菌表达系统中的表达良好,然而重组sll1981蛋白的可溶性和催化活性差异较大。【结论】当pET28bsll1981质粒与pTf16分子伴侣质粒在大肠杆菌中共表达时重组sll1981蛋白的可溶性和催化活性均为最佳。酶动力学测试表明集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白具有α-酮戊二酸脱羧酶功能。为进一步研究α-酮戊二酸脱羧酶的结构功能关系及催化机制提供重要基础。     

苹果AFL1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

AFL1基因是苹果控制花发育的关键基因之一。在已得到AFL1 cDNA基因的基础上,将AFL1克隆到原核表达载体pET28b中,获得了重组表达质粒pET-AFL1,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21中,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳分析,结果显示,AFL1基因在大肠杆菌中成功表达,表达的AFL1融合蛋白分子量大约为53 kD。     

ω-ACTX-Hv1a与AcNPV poledrine基因的重组及重组融合蛋白的表达

合成ω-ACTX-Hv1a基因,并与斜纹夜蛾多角体蛋白(AcNPV Polyhedrin)基因重组,构建重组蛋白表达载体并在大肠杆菌中表达融合蛋白。通过对温度、时间和IPTG诱导浓度等诱导条件的改变,以获得最佳诱导表达条件,所获得的最大量的融合蛋白经初步的纯化获得纯度为大约90%。获得ω-ACTX-Hv1a与polyhedrine基因的重组蛋白工程菌株,为此基因应用于杀虫剂奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的克隆与表达

猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是引起断奶后仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原.笔者用PCR方法扩增PCV2截短的ORF2基因并亚克隆至表达载体pGEX-6P-1,构建的重组表达质粒命名为pGEX-ORF2,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃经IPTG诱导4h.PCV2的cap蛋白以包涵体形式得到有效表达.经SDS-PAGE及Western blot分析表明表达的重组蛋白分子量约为46KD,重组蛋白具有良好的免疫学活性.