猪圆环病毒2型Cap基因原核表达载体的构建及表达

根据GenBank上已发表的PCV2的衣壳蛋白(Cap蛋白)基因设计1对引物,利用PCR方法从已知PCV2病毒中扩增到l条DNA片段,将PCR产物克隆至pMD18-T载体上获得稳定质粒,酶切及测序鉴定后,获得大小为578 bp的Cap基因序列,将该基因插入表达载体pET-30a质粒中,获得重组质粒pET-30a-PCV2-Cap,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。重组质粒pET-30a-PCV2-Cap经IPTG诱导后表达的重组蛋白分子量为28.0kD,经破碎后SDS-PAGE电泳分析表明该蛋白具有可溶性。Western blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达

【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的引物,进行ORF2的PCR体外扩增。用扩增的ORF2基因构建pMD18-T-ORF2质粒,经测序检测正确后,与pET-32a(+)连接获得原核表达重组质粒pET-32a-ORF2。重组质粒pET-32a-ORF2转化BL21-ΔE3后用IPTG诱导表达,对获得的纯化表达产物进行了SDS-PAGE电泳、Western blot检测。【结果】PCR扩增得到了预期580 bp的目的基因,连接载体后经测序完全正确;pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3得到高效表达,获得以包涵体形式存在的体外重组原核表达PCV2 Cap蛋白;Western blot检测结果表明,所得到的蛋白能够识别PCV2多克隆抗体。【结论】重组质粒pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3高效表达重组PCV2 Cap蛋白,且具有免疫学生物活性。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2部分基因的克隆及原核表达

根据发表的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)ORF2基因序列,设计合成1对特异性引物,从分离到的PCV2吉林株(JL01)中扩增出PCV2 ORF2579 bp的核苷酸片段,克隆到表达载体pET-32a中,经BamHⅠ和HindⅢ酶切及序列分析获得阳性重组表达质粒pET-32a-ORF2。将其转化到表达宿主菌BL21中,经IPTG诱导,成功表达了ORF2基因编码的部分结构蛋白,分子量为40 kD。通过SDS-PAGE和Western检测表明,表达的重组蛋白能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的反应原性。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2重组蛋白抗体诊断试剂IgG的研制

应用猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus 2,PCV2)ORF2重组蛋白,研制诊断PCV2的抗体试剂.利用原核表达系统表达PCV2 ORF2蛋白,经12%浓度的SDS-PAGE凝胶电泳分析后免疫家兔制备抗PCV2 ORF2重组蛋白抗体,并用间接酶联免疫吸附试验(indirect-ELISA)确定其效价,然后以Western blotting法分析该抗体特异性.结果表明:PCV2 ORF2重组蛋白被表达,且在免疫家兔后获得效价高、特异性好的抗体.兔抗PCV2-ORF2重组蛋白抗体以其特异性好的特点可以作为免疫诊断试剂.     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达

为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

猪Ⅱ型圆环病毒Cap基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白Cap基因的重组腺病毒表达载体。首先将Cap基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV上,再将重组质粒pAdTrack-CMV／Cap用Pme Ⅰ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-Cap。为进一步研究PCV2腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒3型衣壳蛋白的原核表达和鉴定

[目的]表达出猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap),为PCV3免疫学检测方法建立基础.[方法]用PCR技术扩增PCV3-Cap基因片段,与pET-32a原核表达载体定向连接,构建重组原核表达质粒.经大肠杆菌表达后,通过SDS-PAGE来检测目的蛋白的大小与存在方式,并用小鼠抗PCV3-Cap抗体进行Western blot检测.[结果]用pET-32a原核表达系统成功表达出重组PCV3-Cap融合蛋白,其多以包涵体形式存在,纯化后的融合蛋白能与小鼠抗PCV3-Cap血清发生特异性结合,显示出良好的免疫反应性.[结论]原核表达出具有良好免疫反应性的PCV3 Cap.     

猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫原性分析

【目的】在昆虫细胞表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap),并对表达的重组蛋白~*Cap进行免疫原性分析。【方法】将含有PCV2-ORF2基因的重组杆状病毒质粒Bacmid-ORF2转染昆虫细胞进行蛋白表达试验,再用纯化的~*Cap和质粒pcDNA3.1-ORF2分别免疫小鼠,比较二者的免疫效果。【结果】由PCV2-ORF2基因编码的Cap结构蛋白在昆虫细胞中正确表达,相对分子质量约为32 000。~*Cap能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。~*Cap免疫组在细胞免疫水平及体液免疫水平的免疫效果均优于pcDNA3.1-ORF2免疫组。【结论】重组蛋白~*Cap可替代全病毒,具有PCV2疫苗潜在的应用价值。研究结果为后续的PCV2病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定试验基础。     

PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的表达及与PCV2灭活抗原免疫效果的比较

利用基因克隆方法,将PCV2的ORF2基因PCR扩增并酶切后连入pET-32a载体,构建重组质粒。重组质粒经PCR和酶切鉴定并测序后,转化大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western Blotting分析鉴定后,与PCV2灭活抗原分别与弗氏不完全佐剂乳化,并分别免疫仔猪以比较免疫效力。结果为PCV2的Cap蛋白得到正确表达,免疫保护性试验结果显示,相对于灭活抗原制备的疫苗,表达的Cap蛋白制备的疫苗具有更好的免疫原性和保护效力。     

PCV2·ORF2基因片段在大肠杆菌中的表达与纯化

[目的]为了研究PCV2-ORF2基因片段在大肠杆菌中的表达与纯化。[方法]用PCR方法扩增PCV2 ORF2基因3′端片段,PCR产物经酶切后与经同样处理过的pET32a质粒连接,构建重组质粒。重组质粒经PCR和酶切鉴定并测序后,转化BL21感受态细胞;重组菌液用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。[结果]ORF2基因在大肠杆菌中正确表达,表达的融合蛋白的分子量约为33 ku;在37℃、1 mmol/L浓度下,诱导时间为6 h时表达量最大,占细菌总蛋白的23.62%。表达产物主要以包涵体的形式存在,将包涵体溶解后过Ni-NTA柱纯化可得到较为纯净的目的蛋白。[结论]该研究为猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)和猪皮炎和肾病综合征(PDNS)等疾病的防治奠定了基础。     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白的表达

[目的]检测猪圆环病毒2型（PCV2）核衣壳蛋白（Cap）的表达,为进一步研制PCV2单克隆抗体检测抗原提供参考依据。[方法]根据已经发表的PCV2的衣壳蛋白基因（Cap）设计1对引物,利用PCR方法从已知PCV2病毒中扩增到1条DNA片段。将PCR产物按预定的阅读框架插入表达载体质粒pET28a（＋）中,获得重组质粒pCAP-PCV2,并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中。[结果]序列测定表明,所克隆的序列大小为579 bp,与DQ104422的Cap基因序列一致;通过对菌体裂解物的SDS-PAGE分析证明,携带重组质粒pET-PCV2-Cap的大肠杆菌可以表达可溶性的衣壳蛋白。[结论]PCV2衣壳蛋白能通过表达载体质粒pET28a（＋）进行可溶性表达。     

猪Ⅱ型圆环病毒-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建(初报)

根据GenBank发表的PCV2序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2 ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到了表达猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215(C)。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪Ⅱ型圆环病毒和伪狂犬病毒候选疫苗毒株。     

猪圆环病毒2型感染对猪小肠上皮细胞Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1基因mRNA表达的影响

紧密连接在维持肠道黏膜完整性和免疫系统正常发挥功能中作用重大。【目的】旨在探讨猪圆环病毒2型(PCV2)感染对猪小肠上皮细胞(IPEC)紧密连接的影响。【方法】利用基因克隆获得Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1 (ZO-1)基因的重组质粒并建立荧光定量RT-PCR标准曲线;利用所建立的方法检测PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1mRNA的动态变化。【结果】构建的两种紧密连接蛋白基因的重组质粒荧光定量RT-PCR标准曲线线性关系良好,相关系数均达0.99以上。PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和ZO-1mRNA表达在4、12、24、48、72h均显著下降。【结论】PCV2感染可抑制猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白相关基因的表达,破坏细胞间的紧密连接,增加肠道通透性。     

猪圆环病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备

以大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型(PCV2)重组衣壳蛋白(GST-CAP2)为抗原,以一定的免疫程序接种BALB/c小鼠后,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按常规杂交瘤技术进行融合.以GST-CAP2以及猪圆环病毒1型(PCV1)重组衣壳蛋白(GST-CAP1)为包被抗原,经间接ELISA筛选获得2株能稳定分泌针对PCV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(M1和G1).通过dot-ELISA、Western-blotting以及间接免疫荧光(IFA)技术证明G1株分泌的单抗同时识别PCV1和PCV2, 而M1株分泌的单抗则特异性针对PCV2.该单抗的制备将为进一步建立快速检测PCV的方法奠定基础.     

猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达

利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4~0.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达

利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4⁰.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

猪圆环病毒2型ORF3基因的克隆及原核表达

以细胞总基因组提取试剂盒抽提PCV2细胞毒株总DNA为模板,用特异性引物扩增PCV2 ORF3基因。将ORF3和表达载体pGEX-6p-1用BamH I和Sal I双酶切回收后连接,将测序验证为阳性的重组质粒命名为pGEX-6p-1-ORF3。重组质粒pGEX-6p-1-ORF3转化BL21(DE3)后用IPTG诱导表达并纯化,对获得的表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western blot检测。结果表明:PCV2 ORF3在pGEX-6p-1中获得了高效表达,其表达蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量约为37 kD,且能够和PCV2阳性血清发生特异性相互作用,具有免疫学活性。     

猪圆环病毒2型ORF2基因原核表达蛋白间接ELISA检测方法的建立

[目的]建立一种检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。[方法]从已构建的克隆质粒pMD-ORF2上酶切回收ORF2基因的羧基端部分ORFc片段,克隆到pGEX-6P-1表达载体上,构建原核表达质粒pGEX-ORFc,转化入大肠杆菌BL21进行原核表达,用Western-blot法检测纯化蛋白,将其作为抗原包被酶标板,优化间接ELISA试验条件,从而建立检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。[结果]重组表达质粒的酶切鉴定证明已成功构建重组表达质粒pGEX-ORFc,其在E.coliBL21中诱导5、6 h时表达效果最好。纯化后的蛋白条带与原重组菌位置一致均在40.0 kD处,证明重组蛋白得到良好纯化。试验确定抗原最佳包被浓度为12.85μg/m l,血清稀释度为1∶40。3次重复检测表明,变异系数最大为7.12%。[结论]建立的ELISA方法对检测PCV2感染具有良好的特异性及重复性。     

猪圆环病毒2d亚型病毒样颗粒的制备

为了制备猪圆环病毒2d亚型病毒样颗粒,根据GeneBank上公布的PCV2d亚型HB-MC1株的序列和大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2d亚型ORF2基因,克隆到原核表达载体pET30a(+),获得重组表达质粒pET30a-Cap2d,将该质粒转化入Rosetta(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析,利用Western blot和琼脂凝胶免疫扩散试验鉴定重组蛋白的免疫原性,并利用电镜技术鉴定重组Cap2d蛋白形成的病毒样颗粒。SDS-PAGE结果表明PCV2d的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达;电镜下观察超声破碎后的上清中存在大量直径约17 nm的病毒样颗粒;Western blot和琼脂凝胶免疫扩散试验结果表明该可溶性蛋白可与猪PCV2阳性血清特异性结合,具有较好的免疫原性。本研究为制备PCV2d亚单位疫苗和相关检测试剂盒奠定了基础。     

猪圆环病毒2型感染对猪小肠上皮细胞Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1基因mRNA表达的影响

紧密连接在维持肠道黏膜完整性和免疫系统正常发挥功能中作用重大。【目的】旨在探讨PCV2感染对猪小肠上皮细胞(IPEC)紧密连接的影响。【方法】利用基因克隆获得Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1(ZO-1)基因的重组质粒并建立荧光定量RT-PCR标准曲线;利用所建立的方法检测PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1mRNA的动态变化。【结果】构建的两种紧密连接蛋白基因的重组质粒荧光定量RT-PCR标准曲线线性关系良好,相关系数均达0.99以上。PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和ZO-1 mRNA表达在4、12、24、48、72 h均显著下降。【结论】PCV2感染可抑制猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白相关基因的表达,破坏细胞间的紧密连接,增加肠道通透性。