桃果实生长素结合蛋白ABP1的克隆及表达分析

ABP1是一种能够快速响应生长素信号的结合蛋白,参与细胞伸长、质膜极化、网格蛋白内吞及果实发育等生理过程。以‘24号’桃果实为试验材料,应用荧光实时定量PCR分析PpABP1在桃果实发育过程中的表达量变化,以及外施NAA对桃果实PpABP1表达量的影响。结果表明:PpABP1在桃果实中果皮和种子不同发育时期均有表达,花后52dPpABP1表达量均达到最大值;外施NAA对桃果实发育过程中PpABP1表达量的影响与发育时期相关,在桃果实硬核期,外施NAA会降低PpABP1在中果皮的表达。本试验初步证实桃果实发育过程中存在由ABP1介导的信号转导途径,PpABP1在桃果实中的表达存在发育特异性。     

桃果实生长素结合蛋白ABP1的组织定位及蛋白表达分析

【目的】生长素几乎参与调控植物发育的各个方面。生长素信号转导存在由ABP1（auxin binding protein 1）介导的途径,ABP1作为一种生长素快速响应蛋白参与调控果实发育等生理过程,其主要存在于正在发育的胚及胚的周围组织中。本文旨在研究ABP1是否参与桃果实发育过程,探讨其分布与表达特点,为进一步研究桃果实发育机制奠定理论基础。【方法】以‘24号’桃果实为研究对象,测定其生长曲线以确定果实发育的3个典型时期。分离不同发育时期的中果皮、内果皮和种子,切块后,一部分样品放入EDAC溶液抽真空后进行戊二醛和多聚甲醛固定,固定后的样品经脱水和浸蜡处理后用于石蜡切片;另一部分样品液氮速冻后-80℃保存提取蛋白。制备效价较高的ABP1兔源多克隆抗体,应用免疫组织化学定位技术对自然发育状态下不同发育时期桃果实种子和中果皮中ABP1进行定位分析;应用Western blot技术分析桃果实中果皮、内果皮和种子中ABP1的表达情况。【结果】根据桃果实生长曲线,将发育时期分为3个时期,即第一次快速生长期、硬核期和第二次快速生长期。免疫组织化学定位结果表明,同一发育时期ABP1在种子的不同部位都有分布,且分布信号差异不明显。在种子发育的各时期,ABP1在种子的不同部位都有分布,主要分布在种子的内外种皮细胞以及种皮内维管组织周围的细胞中,且在观测的发育时期内,ABP1的信号强弱没有明显变化。在种子内、外种皮之间的细胞层中会出现零散的、呈带状分布的ABP1信号。而在中果皮发育的整个时期,ABP1只在硬核期维管组织周围的细胞中有明显分布。Western blot结果表明,中果皮中ABP1的表达在果实第一次快速生长期开始（盛花后41 d）及第二次快速生长期开始（盛花后76 d）时的表达量最高,在盛花后39 d的表达量最低。种子中ABP1的表达量要高于中果皮与内果皮。【结论】ABP1在果实内的分布与表达水平存在组织和发育时期的差异性,ABP1因子参与了生长素对桃果实发育的调控过程。     

叶面喷施钾肥对霞脆桃果实品质及KUP基因表达的影响

以霞脆桃为材料,研究了叶面喷施钾肥对果实品质的影响及果实发育中K~+动态平衡与KUP家族基因表达水平之间的联系。结果表明:喷施钾肥显著增加了霞脆桃的鲜质量和体积大小,改善了果皮着色指标,提高了果实可溶性固形物和可溶性糖含量,有效提升了桃果实品质,并有效增强了果实发育不同时期果肉的钾素营养状况;桃KT/HAK/KUP家族基因在桃果实发育不同时期的表达水平存在差异,PpeKUP1基因在霞脆桃整个果实发育期的表达水平最高,其次是PpeKUP5和PpeKUP3,而PpeKUP14～PpeKUP16在果实发育不同时期均没有检测到表达量; PpeKUP1、PpeKUP2和PpeKUP7在转录水平上对喷施钾肥处理最为敏感,其表达水平与对照相比,在第2次果实膨大期(75 DAFB)至达到商业成熟度时(95 DAFB)均显著增强。     

草莓几丁质酶基因FaChi1-FaChi4的转录特性及其对干旱胁迫、外施脱落酸及灰霉菌的响应

为研究草莓中几丁质酶基因的转录特性及其在果实中对生物及非生物胁迫的响应,以"阿尔比"草莓为试验材料,运用实时荧光定量PCR技术对4个几丁质酶基因FaChi1-FaChi4在果实发育过程及不同器官中的表达情况及其对生物及非生物胁迫的响应情况进行研究。结果表明:1)FaChi4主要在果实中表达,在转色期和红熟期有2个表达峰,它在果实发育与成熟过程中的表达水平显著地高于FaChi1-FaChi3。此外,FaChi1主要在营养器官中表达,其中在叶中的表达量最高;FaChi2主要在叶中表达;FaChi3在各个器官中的表达量均相对较低。2)干旱胁迫及灰霉菌处理后,果实中FaChi1-FaChi4的表达均被诱导。外施脱落酸处理可诱导FaChi2与FaChi4的表达。以上结果说明:FaChi1-FaChi4在草莓果实发育过程中有不同的表达模式且具有器官特异性,其中FaChi4是在果实中表达的主要基因;FaChi1-FaChi4在果实对生物及非生物胁迫的响应中有一定的调节作用。     

黄瓜异戊烯基转移酶基因(CsIPT2)的克隆及特征分析

为了分析黄瓜异戊烯基转移酶基因(CsIPT2)在果实发育不同模式中的转录变化以及对不同激素的转录应答情况,对CsIPT2基因进行了克隆和序列分析,再利用荧光定量PCR技术分析该基因在黄瓜单性结实自交系EC1和非单性结实自交系8419s-1果实发育过程中的表达情况,并分析了CsIPT2对不同激素的应答反应。结果表明:CsIPT2基因全长843 bp,共编码280个氨基酸,蛋白空间结构模型与蛇麻IPT蛋白极其相似。该基因不仅在授粉后的黄瓜果实发育中表达量上调,而且在黄瓜天然单性结实前期和人工诱导的单性结实后期表达量均有增加,推测该基因在促进黄瓜果实发育过程中发挥着重要作用,同时也可能参与了黄瓜单性结实的调控过程。GA、ET、6-BA、ABA和NAA 5种激素都能够诱导该基因的上调表达。其中GA处理后3 h基因表达量最高,ET、6-BA、ABA和NAA诱导的表达峰值出现在处理后6 h。随着NAA处理浓度的增加基因的表达量上调幅度增大。     

生长素结合蛋白ABP1基因在棉纤维伸长中的功能

以‘湘杂棉14’为材料,采用RT–PCR方法克隆了棉花ABP1基因全长cDNA序列。序列全长792 bp,与GenBank中陆地棉ABP1基因序列的同源性为99%。半定量分析表明,该基因在棉花叶、花及纤维中都有表达,其中叶中的表达量最高,花和纤维中的表达量稍低。ABP1基因在纤维快速伸长期表达水平较高,纤维发育的其他时期的表达水平较低。将ABP1基因cDNA构建成棉花ABP1过表达载体,并以NPT II作为选择标记,经农杆菌介导转化棉花,获得了6株Kan抗性植株,其中3株ABP1表达水平提高。ABP1过表达植株生长发育正常,但纤维长度变化不显著,说明ABP1棉纤维细胞中提高表达水平对其细胞伸长没有显著作用。     

黄肉桃果实八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆及表达分析

利用基因克隆技术获得桃果实八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的全长核苷酸序列,命名为PpPDS。PpPDS全长2 056bp,编码区长度1 722bp,共编码573个氨基酸。进化树分析发现PpPDS与杏果实PaPDS、草莓FaPDS亲缘性较高。蛋白质序列分析表明PpPDS含有二核苷酸[NAD(H)/NADP(H)或FAD(H)]结合基元,其处于NAD(P)-binding Rossmann-like保守结构域内。实时荧光定量PCR结果显示,PpPDS基因在黄肉品种‘金丽’桃果实发育过程中均有表达,且在果肉中的表达普遍高于果皮。果实处于硬核期的PpPDS基因在果实中的表达显著高于软核果时期,随后其表达处于较高水平并呈平缓趋势。本研究对桃果实PpPDS基因的克隆及表达分析为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机理奠定了良好的基础。     

桃果实PpARF1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】为了探讨转录因子ARF1(Auxin Response Factor)对桃果实发育调控的机制。【方法】以‘24号’桃果实为试验材料,构建桃ARF1基因的原核表达载体pET32a-PpARF1,转化到BL21(DE3)中诱导表达菌体蛋白,筛选出重组蛋白的最适表达条件,按照最适条件大量摇菌诱导表达蛋白,并进行重组蛋白的纯化,最后用纯化诱导后的重组蛋白制备多克隆抗体及WB检测。【结果】SDS-PAGE电泳检测得到pET32a-PpARF1重组蛋白的位置大约在95.0kD,在37℃,转速250r/min,IPTG 0.10mmol/L,诱导4h,诱导出的蛋白表达量最大。免疫印迹试验显示所得抗血清能很好检测到目的蛋白。【结论】ARF转录因子参与生长素调控桃果实发育成熟的过程。     

枣果实糖组分含量动态变化与相关基因表达分析

以新疆3个主栽枣品种(骏枣、灰枣及冬枣)在不同发育时期的果实为试验材料,采用高效液相色谱法测定了在果实发育过程中糖组分含量的变化,并应用实时荧光定量PCR法对12个糖代谢关键基因的表达量进行了分析。试验结果表明:3个品种在果实发育过程中糖组分含量的变化规律大致相同,主要糖组分均为果糖、葡萄糖和蔗糖,前期以果糖和葡萄糖积累为主,蔗糖在后期占据主导地位;不同品种中各基因表达量的变化趋势存在一定差异。相关性分析结果显示:基因ZjSPS1对枣果实中蔗糖和还原糖的积累都具有一定的调控作用,与还原糖的积累相关性更强;ZjSS3和ZjSUC2的表达促进了枣果实中还原糖的积累;ZjHK3的表达在还原糖的积累中起抑制作用;ZjvINV1、ZjvINV2和ZjSUC3的低表达在一定程度上促进了蔗糖的积累。     

枣果实糖组分含量动态变化与相关基因表达分析

以新疆3个主栽枣品种(骏枣、灰枣及冬枣)在不同发育时期的果实为试验材料,采用高效液相色谱法测定了在果实发育过程中糖组分含量的变化,并应用实时荧光定量PCR法对12个糖代谢关键基因的表达量进行了分析.试验结果表明:3个品种在果实发育过程中糖组分含量的变化规律大致相同,主要糖组分均为果糖、葡萄糖和蔗糖,前期以果糖和葡萄糖积累为主,蔗糖在后期占据主导地位;不同品种中各基因表达量的变化趋势存在一定差异.相关性分析结果显示:基因ZjSPS1对枣果实中蔗糖和还原糖的积累都具有一定的调控作用,与还原糖的积累相关性更强;ZjSS3和ZjSUC2的表达促进了枣果实中还原糖的积累;ZjHK3的表达在还原糖的积累中起抑制作用;ZjvINV1、ZjvINV2和ZjSUC3的低表达在一定程度上促进了蔗糖的积累.     

桃果实发育解剖学与果核开裂研究

为探明桃果实发育规律,利用石蜡切片制片法对大久保桃果实发育过程进行了较系统的组织解剖学研究。结果表明:桃子房初期具2个倒生胚珠,大部分只有1个发育成种子;子房壁经过生长发育形成果实的外、中、内果皮;外果皮细胞长柱形,细胞核明显,排列紧密,被表皮毛;中果皮在果实第一次快速生长期为分生组织,果实进入发育的第三个时期时中果皮细胞逐渐液泡化成为薄壁组织;内果皮细胞分裂、分化同时进行,大久保桃从花后第4周开始木质化,按由内到外的顺序进行;但有部分桃果实表现出内果皮木质化不彻底现象,在果缝线相对位置薄壁细胞层数较多,这很可能使内果皮裂开、种胚脱落,而降低桃果的商品价值。     

桃果实发育期间内源IAA含量变化

研究生长素在桃果实中含量变化及其作用,以‘瑞光5号’正常桃、裂核桃、栽培‘久保’桃和野生桃果实为试材,应用酶联免疫法分别测定桃果实不同发育时期,内果皮和中果皮的IAA含量。结果表明：‘久保’桃中果皮前期IAA含量高于野生桃,可能是造成裂核的原因,内果皮中含量变化趋势较一致,但野生桃IAA含量高于‘久保’;‘瑞光5号’成熟期正常桃内果皮与裂核桃IAA含量差异显著,变化趋势不同,花后77d裂核果IAA含量明显高于正常果,表明裂核导致IAA含量异常。说明桃果实在正常发育、成熟及果核开裂过程中与生长素含量存在一定的关系。     

红肉桃两类花色素苷积累模式与相关基因表达差异

【目的】分析中国主要红肉桃种质呈色类型及分子机理,为红肉桃种质优异基因发掘和分子标记辅助选择育种奠定理论基础。【方法】选择8份红肉桃种质和1份白肉桃种质为试材,分别在花后一个月开始采集样品,以后每隔10 d左右采集一次,至果实成熟期为止;用2%甲酸甲醇提取不同种质果肉的花色素苷,分别测定其在510 nm和700 nm的吸光值;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法,测定与花色素苷合成相关的13个关键结构基因和调节基因的表达水平。【结果】根据果实发育中后期花色素苷含量的变化趋势可将8份红肉桃种质分为2类,一类种质的花色素苷合成高峰出现在果实成熟期(成熟期积累型),如‘郑引82-9’‘大红袍’‘黑布袋’‘红桃’和‘天津水蜜’;另一类种质的花色素苷合成高峰出现在果实发育中期,在成熟期花色素苷含量有所下降(发育中期积累型),如‘哈露红’‘大果黑桃’和‘乌黑鸡肉桃’。在与花色素苷合成相关的结构基因中,Pp CHS和Pp UFGT的表达量与成熟期积累型种质的花色素苷含量的变化趋势一致;而发育中期积累型种质,果肉中花色素苷的大量积累与所有结构基因的表达趋势一致。在4个调控基因中,只有Pp MYB10.1的表达水平较高,且表达模式同红肉桃种质两类花色素苷积累模式相似。【结论】根据桃果肉着色规律和花色素苷积累模式,8份红肉桃可以分为成熟期积累型和发育中期积累型种质。Pp CHS和Pp UFGT是成熟期积累型种质的关键结构基因,而Pp MYB10.1在供试的所有红肉桃种质花色素苷合成中起关键作用。     

桃果实的糖酸含量变化及相关性分析

[目的]研究果实发育过程中桃糖酸含量的变化特征。[方法]以盛花后不同发育时期的普通桃、油桃和蟠桃为材料,蒽酮法测定可溶性糖含量,氢氧化钠滴定法测定有机酸含量。[结果]普通桃可溶性糖含量先上升,果实迅速膨大期下降;油桃和蟠桃可溶性糖含量在果实速长生育期前期下降,后期上升,硬核前期下降,之后上升,但发育后期蟠桃可溶性糖含量无明显变化。普通桃有机酸含量在硬核后期和果实迅速膨大前期下降。油桃有机酸含量先下降,又大幅度上升,硬核前期下降,中期无明显变化,之后一直下降。蟠桃有机酸含量先上升后下降。裂果油桃有机酸含量高于正常果。[结论]盛花后不同发育时期的3种桃果实糖酸含量的变化趋势不同。     

桃内果皮木质化与其相关酶的关系

研究了桃果实发育过程中内果皮和中果皮木质素的积累情况与苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂醇脱氢酶(CAD)和过氧化物酶(POD)的关系。结果表明:在果实发育前期(花后2~4周),中、内果皮厚度快速增加,内果皮中的PAL和CAD的活性迅速增加,但是在这一时期内果皮的木质素含量增加非常缓慢;在果实发育的中后期(花后5~7周),果实体积增加减慢,PAL,CAD和POD 3种酶活性开始不同程度的降低,但内果皮的木质素却在快速积累。中果皮与内果皮不同,它的PAL,CAD和POD活性一开始就远远低于内果皮,且木质素含量在整个生长阶段一直维持在1.0%以下的低水平。     

桃果实成熟软化与细胞壁降解相关糖苷酶及乙烯生物合成的关系

【目的】研究不同溶质型桃成熟软化过程中β-半乳糖苷酶（β-Gal）和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-Af）以及乙烯生物合成相关酶（ACC氧化酶ACO和ACC合成酶ACS）的变化。【方法】采用气相色谱测定乙烯释放量;采用常规理化分析方法测定相关酶活性;采用RT-PCR研究相关酶的定性表达,同时采用Real-time PCR分析其表达量的变化。【结果】不同桃品种之间软化特性存在较大差异,‘雨花3号’桃果实成熟过程中,随着果实硬度下降,乙烯释放量明显增加并出现峰值,‘加纳岩’桃果实在成熟过程中一直保持相对较高的硬度且乙烯释放量很低,其最高值不及‘雨花3号’桃果实乙烯释放量的1%;β-Gal基因表达量和活性在桃果实成熟软化前期较高,α-Af基因表达和活性在成熟软化后期较高,且α-Af的快速变化期滞后于乙烯及其合成相关酶的变化。【结论】β-Gal酶对桃果实早期阶段的软化启动有较大影响,且两类桃果实β-Gal基因表达和β-Gal活性可能存在不同的诱导机制; α-Af对桃果实成熟中后期快速软化影响更显著且α-Af的激活与果实内源乙烯的积累密切相关。     

赤霉素对梨糖代谢及其关键酶基因表达的影响

为了研究赤霉素增强果实库强的机制,以‘翠冠’梨(Pyrus pyrifolia Nakai)为试材,研究了赤霉素(GA)处理下果实膨大过程中果糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇和可溶性总糖含量变化及山梨糖醇和蔗糖代谢关键酶基因转录水平的影响。结果表明,6-磷酸山梨糖醇脱氢酶基因(S6PDH)表达量前期较低,随着果实膨大逐渐升高,并且GA促进S6PDH在果实膨大中后期的表达;山梨糖醇代谢关键酶NAD-山梨糖醇脱氢酶基因(NAD-SDH)在果实膨大前期相对表达量很高,GA抑制了果实膨大前期NAD-SDH的表达。在蔗糖代谢中,酸性转化酶基因(SI)的表达量随着果实的膨大逐渐上升,在膨大中期达到高峰,然后开始下降,且果肉中SI表达量较果芯中的高,GA显著促进果实膨大期果实中SI的表达。果芯中蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)表达量随着果实成熟而持续增加,果芯中表达水平较高于果肉中,GA显著提高果实膨大中后期SPS的表达水平。蔗糖合成酶基因(SS)在果实膨大前期和中期表达水平较高,GA处理抑制SS表达。GA处理显著提高梨果肉和果芯组织中的可溶性糖含量,GA诱导糖代谢相关酶的基因的表达,并在果芯和果肉中存在空间表达差异。     

桃果实ζ-胡萝卜素脱氢酶基因克隆及表达分析

[目的]克隆桃果实ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(PpZDS)的全长序列,并对其进行生物信息学及表达分析,为研究桃果实类胡萝卜素生物合成的分子机理提供参考.[方法]从黄肉品种桃果实中克隆PpZDS基因,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在桃果实不同成熟期的表达情况.[结果]克隆获得的PpZDS基因全长2014 bp,具有完整的编码区,长度为1716 bp,编码571个氨基酸.PpZDS蛋白含有ZDS特征序列(KVAIIGA-GLAGMSTAVELLDQGHEVDIYESR),属于NAD_binding_8超级家族保守结构域.PpZDS蛋白与同为蔷薇目的苹果(gi|33313474)和草莓(gi|256041892)的ZDS蛋白亲缘关系较近,物种间分化程度较小.整个桃果实成熟期PpZDS基因在果肉和果皮中均有表达,从软核期至硬熟期均呈逐渐升高趋势,硬熟期达最高,完熟期降低;不同桃果实发育期果肉中的PpZDS基因表达量均大于果皮中表达量,其中硬核期、硬熟期和完熟期的桃果实中PpZDS基因在果肉中的表达量显著高于果皮中的表达量(P<0.05).[结论]PpZDS基因表达对桃果实类胡萝卜素生物合成及呈色发挥正向调控作用.     

桃果实内果皮木质素沉积的动态变化

为研究桃果实内果皮的发育机理及裂核果形成的可能原因,本试验以‘露王仙’桃果实为试材,利用木质素特定显色反应,研究木质素在桃果实内果皮中的沉积过程以及裂核果木质素沉积的变化。结果表明:花后39d起,桃果实内果皮由种尖开始有木质素沉积,然后从里向外逐渐木质化,花后60d木质化过程完成。裂核果的内果皮没有完全木质化,核开裂部位形成愈伤组织。